本發(fā)明涉及引物檢測領(lǐng)域，特別涉及一種柯薩奇a6的全基因組捕獲引物組合、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、手足口病(hand-foot-mouth?disease,hfmd)是由多種腸道病毒(enterovirus,ev)感染引起的常見傳染病，主要病原包括柯薩奇病毒a組(coxsackievirus?a,ca)4—7、9、10、16型和b組1—3、5型，?？刹《镜牟糠盅逍秃蚭v71等。手足口病多發(fā)于0-5歲嬰幼兒，典型表現(xiàn)為發(fā)熱，手、足、臀、口腔等部位的斑丘疹、皰疹，目前cva6已超過ev71和cva16成為hfmd的主要病原體，柯薩奇病毒a6引起的手足口病，該型皮損更廣泛、更嚴重，水皰大皰性皮損可累及手背、足背、小腿、前臂、軀干及頸部、口周，嚴重癥狀導(dǎo)致可能危及生命的腦炎及肺出血等并發(fā)癥。

2、cva6屬小核糖核酸病毒科腸道病毒屬a組，呈二十面體球型，無包膜，為單股正鏈rna，基因組全長約7?400bp，包含1個開放閱讀框及5′和3′非編碼區(qū)。cva6具有ev的一般理化特性，耐低溫耐酸，但可在高于56℃的溫度下失去活性，對干燥、紫外線和氧化劑較敏感。cva6毒株可分為6種基因型，分別為a至f，d基因型可進一步細分為d1-3亞型。

3、目前針對于cva6的研究和鑒定主要有以下幾種方法：1.傳統(tǒng)血清學(xué)方法：采集患者血液樣本，分離血清后使用特異性抗原進行檢測，然而這種方法耗時久，且病毒分離有失敗的可能，靈敏度不夠；2.常規(guī)定量pcr方法：根據(jù)cva6核酸序列特點設(shè)計引物和探針，在特定的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，通過擴增特異性目的片段對cva6的存在和豐度進行鑒定，然而定量pcr只能鑒定存在柯薩奇cva6病毒存在，無法進行更進一步的基因序列分析和分型；3.測序方法：目前針對于柯薩奇病毒的測序研究較多的是vp1基因，通過設(shè)計引物對vp1基因進行靶向擴增和測序，對得到的序列進行構(gòu)建進化樹等分析。比如cn107513584b提供的一種檢測腸道病毒的五毒熒光定量試劑盒，也僅是能夠鑒定cva6病毒但無法進行全基因組研究和分型鑒定。

4、綜上所述，目前市面上暫無針對于柯薩奇a6的全基因組的研究，導(dǎo)致無法很好地理解病毒的遺傳變異、進化關(guān)系，以及無法很好地針對該病毒進行有效防控措施。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種柯薩奇a6的全基因組捕獲引物組合、試劑盒及應(yīng)用，針對柯薩奇a6亞型的全基因組按照疊瓦式原理設(shè)計了7對引物的引物池，利用引物池實現(xiàn)cva6亞型全基因組產(chǎn)物的反轉(zhuǎn)錄與富集擴增。

2、為實現(xiàn)以上目的，本技術(shù)方案提供了一種柯薩奇a6的全基因組捕獲引物組合，包括：

3、第一引物池，其中第一引物池包括序列如seq?id?no.1-seq?id?no.3的第一引物對、序列如seq?id?no.6-seq?id?no.7的第三引物對、序列如seq?id?no.10-seq?id?no.11的第五引物對、序列如seq?id?no.14-seq?id?no.16的第七引物對；

4、第二引物池，其中所述第二引物池包括序列如seq?id?no.4-seq?id?no.5的第二引物對、序列如seq?id?no.8-seq?id?no.9的第四引物對、序列如seq?id?no.12-seq?idno.13的第六引物對；

5、第一引物池和第二引物池內(nèi)的引物對的引物序列依次交叉重疊。

6、本方案提供的柯薩奇a6的全基因組捕獲引物組合針對cva6亞型的全基因組按照疊瓦式原理設(shè)計了7對引物對，相鄰引物對之間存在重疊的重疊序列，進而避免了在擴增過程中缺失全基因組中的部分片段。不僅如此，本方案將7對引物對中相鄰的具有重疊序列的引物對分為兩個引物池，利用兩個引物池對cva6亞型進行全基因組分段擴增，避免優(yōu)先擴增相對較短的重疊序列，最后把擴增產(chǎn)物混合就得到了cva6亞型全基因組產(chǎn)物，實現(xiàn)cva6亞型全基因組反轉(zhuǎn)錄與富集擴增，最終得到的dna產(chǎn)物可用于各種分子生物學(xué)實驗，包括二代和三代全基因組測序?qū)嶒灐?/p>

7、在一些實施例中，第一引物對、第二引物對、第三引物對、第四引物對、第五引物對、第六引物對和第七引物對通過疊瓦式pcr原理設(shè)計得到。本方案的第一引物池和第二引物池內(nèi)的引物對的引物序列依次交叉重疊指的是：第二引物池內(nèi)的偶數(shù)值對應(yīng)的引物對同第一引物池內(nèi)的相鄰的奇數(shù)值對應(yīng)的引物對具有重疊序列。

8、具體的：

9、第二引物池內(nèi)的第二引物對同第一引物池的第一引物對以及第三引物對分別具有重疊序列；

10、第二引物池內(nèi)的第四引物對同第一引物池的第三引物對以及第五引物對分別具有重疊序列；

11、第二引物池內(nèi)的第六引物對同第一引物池內(nèi)的第五引物對以及第七引物對分別具有重疊序列。

12、另外，第一引物池內(nèi)的不同引物對彼此之間不具有重疊序列，第二引物池內(nèi)的不同引物對之間也不具有重疊序列。

13、在一些實施例中，第一引物對包括seq?id?no.1所示的左引物、seq?id?no.2的左引物和seq?id?no.3所示的右引物，第二引物對包括seq?id?no.4所示的左引物和seq?idno.5所示的右引物，第三引物對包括seq?id?no.6所示的左引物和seq?id?no.7所示的右引物，第四引物對包括seq?id?no.8所示的左引物和seq?id?no.9所示的右引物，第五引物對包括seq?id?no.10所示的左引物和seq?id?no.11所示的右引物，第六引物對包括seq?idno.12所示的左引物和seq?id?no.13所示的右引物，第七引物對包括seq?id?no.14所示的左引物、seq?id?no.15所示的右引物和seq?id?no.16所示的右引物。同一引物對內(nèi)的左引物將結(jié)合到目標dna的正鏈上，并從5'端向3'端延伸，相對的右引物將結(jié)合到結(jié)合到目標dna的負鏈上，并同樣從5'端向3'端延伸，進而實現(xiàn)特異性地擴增復(fù)制。關(guān)于第一引物池和第二引物池的引物序列如表一所示：

14、表一引物序列表

15、

16、

17、

18、在一些實施例中，第一引物池和第二引物池內(nèi)的每一引物對的擴增片段在1024-1200bp，優(yōu)選在1200bp的長度，確保擴增產(chǎn)物的高效性與保真性；且每一引物對選擇在保守性較高的區(qū)域。

19、具體的，第一引物對覆蓋1-1294bp的位置，第二引物對覆蓋1102-2381bp的位置，第三引物對覆蓋2159-3330bp的位置，第四引物對覆蓋3190-4469bp的位置，第五引物對覆蓋4218-5505bp的位置，第六引物對覆蓋5369-6572bp的位置，第七引物對覆蓋6390-7414bp的位置。

20、在一些實施例中，同時在第一引物對中添加了一條正向引物，第七引物對中添加了一條反向引物。這樣做的好處在于有很多病毒的參考基因組的首尾是不全的，設(shè)計引物的時候只有很少的序列可以參考，引物設(shè)計容易出現(xiàn)脫靶，因此在首尾位置多增加一條額外的引物來確保擴增效果。

21、第二方面，本方案提供了一種柯薩奇a6的全基因組捕獲試劑盒，包括：第一方面提到的柯薩奇a6的全基因組捕獲引物組合以及反轉(zhuǎn)錄試劑。

22、本方案利用柯薩奇a6的全基因組捕獲試劑盒中提到的高熱穩(wěn)定性、高效的反轉(zhuǎn)錄酶可從純化的總dna中一致且快速地合成cdna，利用本方案提供的引物組合可擴增得到柯薩奇a6全基因組，本方案得到柯薩奇a6全基因組可用于各種分子生物學(xué)實驗，包括二代和三代全基因組測序?qū)嶒灐?/p>

23、在一些實施例中，本方案提供的柯薩奇a6的全基因組捕獲試劑盒可用于擴增柯薩奇a6全基因組產(chǎn)物，且柯薩奇a6全基因組產(chǎn)物可用于二代和三代全基因組測序?qū)嶒灐?/p>

24、在一些實施例中，本方案提供的柯薩奇a6的全基因組捕獲試劑盒面向于鼻咽拭子、肛拭子、皰疹液環(huán)境中提取的核酸樣本進行柯薩奇a6全基因組產(chǎn)物的捕獲。

25、第三方面，本方案提供了一種柯薩奇a6的全基因組捕獲的非診斷方法，包括：

26、獲取待測核酸樣本；

27、利用反轉(zhuǎn)錄試劑對待測核酸樣本進行逆轉(zhuǎn)錄得到cdna鏈；

28、對cdna鏈用第一引物池進行多重pcr擴增得到第一擴增產(chǎn)物；

29、對cdna鏈用第二引物池進行多重pcr擴增得到第二擴增產(chǎn)物；

30、合并第一擴增產(chǎn)物和第二擴增產(chǎn)物得到柯薩奇a6全基因組。

31、在“利用反轉(zhuǎn)錄酶對待測核酸樣本進行逆轉(zhuǎn)錄得到cdna鏈”步驟中，按照如下表二所示的反應(yīng)程序進行反轉(zhuǎn)錄得到cdna鏈，

32、表二反轉(zhuǎn)錄程序表

33、 步驟 溫度 時間 循環(huán) 1 25℃ 10分鐘 1 2 50℃ 10分鐘 1 3 85℃ 5分鐘 1 4 4℃ 保持 ?

34、。

35、在一些實施例中，選用rt?super?mix作為反轉(zhuǎn)錄試劑，rt?super?mix是一種用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的預(yù)混試劑，通常包含所有必需的成分以進行高效的反轉(zhuǎn)錄過程，包括反轉(zhuǎn)錄酶、隨機引物、dntps、緩沖液、rnase抑制劑和其他輔助因子。

36、在“對cdna鏈用第一引物池進行多重pcr擴增得到第一擴增產(chǎn)物，對cdna鏈用第二引物池進行多重pcr擴增得到第二擴增產(chǎn)物”步驟中，多重pcr擴增的條件相同，多重pcr擴增條件為：循環(huán)1：在98℃進行30秒；循環(huán)2：在98℃進行15秒并在63℃下進行5分鐘；循環(huán)3：在98℃進行15秒并在65℃下進行4分鐘；循環(huán)4：在72℃進行2分鐘；循環(huán)5：在4℃保持，其中循環(huán)2進行5個循環(huán)，循環(huán)3進行25個循環(huán)。

37、本方案提供的多重pcr擴增的pcr程序表如表三所示：

38、表三pcr程序表

39、

40、

41、

42、在一些實施例中，對柯薩奇a6全基因組進行測序，選擇為二代測序平臺或者三代測序平臺。

43、相較現(xiàn)有技術(shù)，本技術(shù)方案具有以下特點和有益效果：

44、本方案通過疊瓦式pcr原理設(shè)計了具有重疊的序列部分的7對引物，且將7對引物分成兩個引物池分別進行分段擴增，每段擴增片段長度約1200bp，確保擴增產(chǎn)物的高效性與保真性，最后把擴增產(chǎn)物混合就得到了cva6亞型全基因組產(chǎn)物。具體的，本方案利用疊瓦式pcr設(shè)計的7對相互重疊的引物，以確?？梢詳U增得到cva6亞型全基因組的全長序列，進而可以準確地對cva6所有變異株進行分型，針對不同的變異設(shè)計了簡并堿基去覆蓋，確保能成功擴增大部分cva6毒株，另外本方案設(shè)計的7對引物相較于cva6亞型基因組而言具有擴增長度適宜且穩(wěn)定性較強的優(yōu)勢，每對引物選擇在保守性最高的區(qū)域，同時在第一對引物中添加了一條正向引物，最后一對引物中添加了一條反向引物，保證對不同變異樣本的擴增靈敏度和效率；同時考慮到若將7對引物一起進行擴增可能會導(dǎo)致引物擴增比較短的重疊區(qū)域的問題，本方案將7對引物分成兩個引物池進行分段擴增。

45、本方案提供的柯薩奇a6的全基因組捕獲引物組合、試劑盒及應(yīng)用具有兼容性好：可實現(xiàn)cva6所有變異株和分型的全基因組擴增；覆蓋度高：擴增得到的序列能覆蓋cva699％以上的完整序列，覆蓋度均一；適配性好的優(yōu)勢特點。