本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及rho基因的6個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)(c.50c＞t、c.68c＞a、c.151g＞c、c.310g＞a、c.403c＞t、c.647t＞a)的聯(lián)檢并進(jìn)行區(qū)分的組合物、方法和用途。

背景技術(shù)：

1、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis?pigmentosa，rp)是一種遺傳性視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病，以進(jìn)行性感光細(xì)胞死亡和視網(wǎng)膜色素上皮(retinal?pigment?epithelium,rpe)細(xì)胞萎縮為特征，最初表現(xiàn)為夜盲、管狀視野、視網(wǎng)膜色素沉積，一般視桿細(xì)胞先受累，進(jìn)而引起視錐細(xì)胞退化，最終可導(dǎo)致病人失明。

2、rp是人類遺傳性失明的主要原因，全球rp患病率為1/7000-1/3000，中國約為1/4000。該病發(fā)病原因復(fù)雜，rp具有高度的遺傳異質(zhì)性，遺傳上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)90多個(gè)致病基因，rp遺傳方式復(fù)雜，主要包括常染色體顯性遺傳(autosomal?dominant?retinitispigmentosa，adrp，占rp的30-40％)，常染色體隱性遺傳(autosomal?recessive?retinitispigmentosa，arrp，占rp的50-60％)，x連鎖隱性遺傳(x-linked?retinitis?pigmentosa，xlrp，占rp的5-15％)，以及發(fā)病率低的雙基因遺傳和線粒體遺傳。

3、常染色體顯性遺傳adrp的主要致病基因有rho，prpf31，rp1等，其中rho致病率最高，占adrp的26％。rho基因突變被認(rèn)為是以常染色體顯性方式遺傳的rp的致病基因；研究表明，rho編碼視紫紅質(zhì)；視紫紅質(zhì)是視桿細(xì)胞的視色素，通過改變環(huán)磷酸鳥苷的濃度調(diào)控細(xì)胞的膜電位，產(chǎn)生電信號(hào)，并通過視神經(jīng)傳遞到視皮層形成視覺。大多數(shù)rho突變會(huì)導(dǎo)致紫紅蛋白在感光細(xì)胞中高水平表達(dá)，使得大量的突變蛋白在細(xì)胞中定位異常并聚集，造成感光細(xì)胞凋亡，不能行使正常的光信號(hào)傳導(dǎo)功能，阻礙光信號(hào)的傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致失明。這些研究表明，rho在維持眼睛感光細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程發(fā)揮了重要作用。rho基因的錯(cuò)義突變，導(dǎo)致感光細(xì)胞凋亡，影響其正常的光轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，最終導(dǎo)致眼部失明的發(fā)生。

4、因此，本領(lǐng)域需求一種能夠在早期快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)rho基因的錯(cuò)義突變的產(chǎn)品和方法，助力視網(wǎng)膜色素變性的早期干預(yù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，選擇了rho基因的6個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)(c.50c＞t、c.68c＞a、c.151g＞c、c.310g＞a、c.403c＞t、c.647t＞a)，建立了基于飛行時(shí)間質(zhì)譜(mald1-tof-ms)技術(shù)的單一反應(yīng)檢測(cè)這6個(gè)突變位點(diǎn)的高通量檢測(cè)。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)rho基因多態(tài)性位點(diǎn)的組合物，包括：

3、第一核酸組合物：

4、如seq?id?no:1～2所示的檢測(cè)c.50c＞t的上下游引物；

5、如seq?id?no:1～2所示的檢測(cè)c.68c＞a的上下游引物；

6、如seq?id?no:5～6所示的檢測(cè)c.151g＞c的上下游引物；

7、如seq?id?no:8～9所示的檢測(cè)c.310g＞a的上下游引物；

8、如seq?id?no:11～12所示的檢測(cè)c.403c＞t的上下游引物；以及

9、如seq?id?no:14～15所示的檢測(cè)c.647t＞a的上下游引物；和

10、第二核酸組合物：

11、如seq?id?no:3所示的檢測(cè)c.50c＞t的單堿基延伸引物；

12、如seq?id?no:4所示的檢測(cè)c.68c＞a的單堿基延伸引物；

13、如seq?id?no:7所示的檢測(cè)c.151g＞c的單堿基延伸引物；

14、如seq?id?no:10所示的檢測(cè)c.310g＞a的單堿基延伸引物；

15、如seq?id?no:13所示的檢測(cè)c.403c＞t的單堿基延伸引物；以及

16、如seq?id?no:16所示的檢測(cè)c.647t＞a的單堿基延伸引物。

17、進(jìn)一步地，所述第一核酸組合物進(jìn)行多重pcr反應(yīng)，所述第二核酸組合物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。

18、在本發(fā)明中，rho基因的genebank登錄號(hào)為nm_000539.3。

19、本發(fā)明采用多重pcr技術(shù)及核酸質(zhì)譜。在一管反應(yīng)液中能同時(shí)檢測(cè)rho基因的6個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)c.50c＞t、c.68c＞a、c.151g＞c、c.310g＞a、c.403c＞t、c.647t＞a。一個(gè)樣本，只需進(jìn)行一次核酸提取和單管pcr擴(kuò)增，所需樣本量低，靈敏度和準(zhǔn)確度高，檢出限低，能夠及時(shí)、有效地檢測(cè)rho基因突變，輔助視網(wǎng)膜色素變性早期干預(yù)。

20、進(jìn)一步地，所述組合物包括檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的上下游引物和單堿基延伸引物。

21、在一些具體的實(shí)施方案中，內(nèi)標(biāo)是人源內(nèi)標(biāo)基因。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，內(nèi)標(biāo)是人管家基因。

22、進(jìn)一步地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以同時(shí)包括上述引物對(duì)和單堿基延伸引物中的一組或多組。在本發(fā)明中，“組”是指檢測(cè)一個(gè)靶點(diǎn)的互相匹配的上下游引物和單堿基延伸引物。

23、本發(fā)明的組合物可以任意組合成檢測(cè)對(duì)應(yīng)6個(gè)靶點(diǎn)的任意組合形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行組合，檢測(cè)哪幾個(gè)靶點(diǎn)，即把對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的引物對(duì)和單堿基延伸引物進(jìn)行組合即可。這些組合形式均包括在本發(fā)明中。

24、舉例來說，6組引物中的任意5組，6組引物中的任意4組，6組引物中的任意3組，6組引物中的任意2組，6組引物中的任意1組。

25、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述第一核酸組合物組合物的各成分存在于一個(gè)包裝中；所述第二核酸組合物組合物的各成分存在于另一個(gè)包裝中。

26、進(jìn)一步地，本發(fā)明的所述包裝的各成分以混合的形式存在。

27、第二方面，本發(fā)明提供了上述本發(fā)明檢測(cè)rho基因多態(tài)性位點(diǎn)的組合物在制備檢測(cè)視網(wǎng)膜色素變性的試劑盒中的用途，其中，所述6個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)是c.50c＞t、c.68c＞a、c.151g＞c、c.310g＞a、c.403c＞t、c.647t＞a。

28、第三方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)rho基因多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述本發(fā)明的組合物。

29、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括dna聚合酶、dntp、pcr緩沖液以及mg2+中的至少一種。

30、更進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括sap酶、sap緩沖液中的至少一種。

31、更進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括單堿基延伸反應(yīng)酶、單堿基延伸緩沖液、以及單堿基延伸終止液中的至少一種。

32、進(jìn)一步地，所述dna聚合酶的濃度為3u/反應(yīng)～15u/反應(yīng)，例如dna聚合酶可以是taq酶。

33、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。

34、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，陰性質(zhì)控品是depc?h2o、生理鹽水、內(nèi)標(biāo)基因中的至少一種。陽性質(zhì)控品是rho基因的野生型和突變型克隆質(zhì)粒。

35、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括核酸釋放試劑、核酸提取試劑。

36、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒包括：taq酶、sap酶、單堿基延伸反應(yīng)酶、mg2+、dntps、引物、pcr緩沖液、sap緩沖液、單堿基延伸緩沖液、單堿基延伸終止液，所述引物包括上下游引物和單堿基延伸引物。

37、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，單個(gè)pcr反應(yīng)管中反應(yīng)物總體積為8-18μl。

38、第四方面，本發(fā)明提供了一種組合物制備檢測(cè)rho基因多態(tài)性位點(diǎn)的試劑的用途，所述檢測(cè)包括以下步驟：

39、1)提取或釋放待測(cè)樣本的核酸；

40、2)使用如上所述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對(duì)步驟1)獲得的核酸進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

41、3)對(duì)步驟2)所獲得的產(chǎn)物進(jìn)行sap反應(yīng)；

42、4)對(duì)步驟3)所獲得的產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)；

43、5)獲得并分析結(jié)果。

44、在本發(fā)明中，用于檢測(cè)的樣本可以是血清、血液等，但不限于此。

45、進(jìn)一步地，所述pcr的反應(yīng)條件為：

46、預(yù)變性，溫度為95℃，時(shí)間為120秒，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時(shí)間為30秒，退火，溫度為56℃，時(shí)間為30秒，延伸，72℃，時(shí)間為1分鐘，45次循環(huán)，最后繼續(xù)72℃延伸5分鐘，1次循環(huán)。

47、進(jìn)一步地，所述sap反應(yīng)條件為：37℃40分鐘，85℃5分鐘。

48、進(jìn)一步地，所述單堿基延伸反應(yīng)條件為：95℃30s，(95℃5s，(52℃5s，80℃5s)5次循環(huán))40次循環(huán)，72℃3分鐘。

49、第五方面，本發(fā)明提供了一種以非診斷目的檢測(cè)rho基因多態(tài)性位點(diǎn)的方法，所述方法包括以下步驟：

50、1)提取或釋放待測(cè)樣本的核酸；

51、2)使用如上述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對(duì)步驟1)獲得的核酸進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

52、3)對(duì)步驟2)所獲得的產(chǎn)物進(jìn)行sap反應(yīng)；

53、4)對(duì)步驟3)所獲得的產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)；

54、5)獲得并分析結(jié)果。

55、進(jìn)一步地，所述pcr的反應(yīng)條件為：

56、預(yù)變性，溫度為95℃，時(shí)間為120秒，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時(shí)間為30秒，退火，溫度為56℃，時(shí)間為30秒，延伸，72℃，時(shí)間為1分鐘，45次循環(huán)，最后繼續(xù)72℃延伸5分鐘，一次循環(huán)。

57、進(jìn)一步地，所述sap反應(yīng)條件為：37℃40分鐘，85℃5分鐘。

58、進(jìn)一步地，所述單堿基延伸反應(yīng)條件為：95℃30s，(95℃5s，(52℃5s，80℃5s)5次循環(huán))40次循環(huán)，72℃3分鐘。