本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種心肌細(xì)胞信號檢測平臺。

背景技術(shù)：

1、心血管疾病居人類死亡病因首位，而藥物引起的心臟毒性是導(dǎo)致藥物研發(fā)失敗的主要原因。心肌芯片作為一種新興的臨床前篩選方法，在早期預(yù)測藥物引發(fā)的心臟毒性、有效降低臨床應(yīng)用中的健康隱患有著可觀的潛力。心肌細(xì)胞具備電生理特性，其電生理信號可直接反映細(xì)胞生理狀態(tài)。以心律失常為代表的心血管疾病以及心臟毒性藥物會導(dǎo)致心肌細(xì)胞電生理信號發(fā)生改變，通過檢測心肌細(xì)胞的電學(xué)特性來進(jìn)行藥物篩選、藥物分析與疾病模型的分析變得越來越普遍。針對心肌細(xì)胞特殊的電生理特性，研究人員已經(jīng)開發(fā)出許多工具或方法來表征心肌細(xì)胞的電生理參數(shù)。

2、微電極陣列(microelectrode?array,mea)作為一種無創(chuàng)檢測、高靈活性、高分辨率的傳感器件，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得了極大關(guān)注。mea可以通過檢測離子跨膜運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的電勢差，獲取心肌細(xì)胞胞外場電位信號。為了更為準(zhǔn)確、高效地獲取細(xì)胞電生理信號，研究人員針對mea開展了深入的研究。

3、在剛性基底上制備的mea是檢測心肌細(xì)胞電生理信號最常規(guī)的工具。硅和玻璃等剛性基底與半導(dǎo)體技術(shù)結(jié)合良好，至今仍被廣泛使用。然而剛性mea存在的最大問題是與柔性生物組織力學(xué)性能不匹配。剛性mea常用基材硅和玻璃的楊氏模量在gpa范圍內(nèi)，與楊氏模量約為0.02-0.5mpa的柔性心肌組織或細(xì)胞存在顯著的機(jī)械失配。相關(guān)研究證明，與生物組織存在顯著硬度差異的基底會改變未成熟細(xì)胞的機(jī)電行為，影響細(xì)胞形態(tài)、收縮力和電信號傳輸。

4、目前，使用柔性材料作為基底從而提供與心肌組織模量適配的環(huán)境，是一種提高未成熟心肌細(xì)胞成熟度的常見方法。利用噴墨打印、絲網(wǎng)印刷等技術(shù)在pdms、水凝膠等柔性基底上制備微電極陣列，通常具有較好的柔性與可拉伸性，能夠在重復(fù)拉伸循環(huán)下保持機(jī)械和電氣性能。然而有一個(gè)無法避免的問題是細(xì)胞仍在柔性基底上貼壁生長，不符合其各向異性、富含豐富微納結(jié)構(gòu)的天然生長環(huán)境。為了進(jìn)一步模擬心肌細(xì)胞的天然生長環(huán)境，研究人員通過構(gòu)建地形線索和提供細(xì)胞支架等方式實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)環(huán)境的還原。利用微接觸印刷和微模塑成型的方法可以在mea上實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的地形誘導(dǎo)和蛋白誘導(dǎo)，使細(xì)胞高度有序，但是從微觀角度出發(fā)，單個(gè)細(xì)胞仍處于貼壁狀態(tài)，其生長和成熟受到限制。在剛性mea表面制備pla/pcl支架，為心肌細(xì)胞黏附和生長提供更有利的環(huán)境，也可以記錄到更成熟的細(xì)胞形態(tài)。然而僅僅通過模擬心肌細(xì)胞天然生長環(huán)境從而促進(jìn)細(xì)胞成熟的方法仍有局限性，一種既能最大限度模擬心肌細(xì)胞生長環(huán)境，又能為細(xì)胞提供激勵(lì)，從而進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)成熟與機(jī)電行為表達(dá)成熟的心肌細(xì)胞電生理信號檢測平臺亟待開發(fā)，這對于心臟毒性藥物檢測的可靠性至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種具有纖維支架-柔性微梁復(fù)合體的心肌細(xì)胞信號檢測平臺，能夠促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)與功能成熟并實(shí)現(xiàn)對工程化心肌組織電生理信號的長期穩(wěn)定記錄。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種心肌細(xì)胞信號檢測平臺，包括纖維支架-柔性微梁復(fù)合體，纖維支架-柔性微梁復(fù)合體為自下而上依次堆疊的第一微梁結(jié)構(gòu)柔性層、金屬微電極陣列、第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層和有序纖維支架：

4、第一微梁結(jié)構(gòu)柔性層上鏤空形成若干平行的微梁，微梁向第一方向延伸；

5、金屬微電極陣列包括若干金屬微電極，金屬微電極具有檢測端和接口端，檢測端與接口端電性連接，多個(gè)金屬微電極的檢測端陣列排布于第一微梁結(jié)構(gòu)柔性層上，接口端沿第一微梁結(jié)構(gòu)柔性層的邊沿設(shè)置；

6、第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層覆蓋金屬微電極陣列的大部分表面并暴露出檢測端和接口端；

7、有序纖維支架包括若干定向排列的纖維絲，纖維絲向第二方向延伸，第一方向與第二方向垂直。

8、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，纖維絲的密度為400-1000根/mm，有序纖維支架的厚度為3～10μm。

9、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，在第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層上制備有序纖維支架的方法包括如下步驟：

10、①將聚己內(nèi)酯溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至澄清，得到纖維絲溶液；

11、②將包括第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層的器件貼于滾筒上，然后在第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層上通過靜電紡絲噴射纖維絲溶液，得到集成有有序纖維支架的器件；

12、③將集成有有序纖維支架的器件從滾筒上取下，去除多余的纖維絲，得到纖維支架-柔性微梁復(fù)合體；

13、其中，第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層的微梁的延伸方向?yàn)闈L筒的軸向方向；

14、靜電紡絲的操作條件為：噴絲針頭施加電壓5～20kv，滾筒接地，滾筒與噴絲針頭的相對距離為10～30cm，纖維絲溶液的推進(jìn)速度為100～1000μl/h，滾筒的轉(zhuǎn)速為500～2000rpm，靜電紡絲的時(shí)間為5～20min。

15、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，微梁為直線型、折線形或曲線型。

16、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，微梁的寬度為400～1000μm，相鄰的兩根微梁之間的距離為1～1.5mm。

17、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，第一微梁結(jié)構(gòu)柔性層的厚度微200～500μm，第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層的厚度微10～20μm。

18、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，金屬微電極的厚度為100～500nm，檢測端的特征尺寸為50～200μm，相鄰兩個(gè)檢測端的間距為400～2000μm，接口端的特征尺寸為1～2mm。

19、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，金屬微電極為惰性貴金屬制成的薄膜，檢測端和接口端分別為薄膜相對的兩端。

20、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，心肌細(xì)胞信號檢測平臺還包括相對設(shè)置的兩個(gè)培養(yǎng)腔；

21、培養(yǎng)腔具有深度為2～5mm、容積為5～15mm的腔體，兩個(gè)培養(yǎng)腔的腔體相對設(shè)置；

22、纖維支架-柔性微梁復(fù)合體設(shè)置于兩個(gè)培養(yǎng)腔之間并分別與兩個(gè)培養(yǎng)腔不可逆鍵合。

23、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，腔體為氣動(dòng)腔室。

24、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，纖維絲的材質(zhì)為聚己內(nèi)酯。

25、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，第一微梁結(jié)構(gòu)柔性層的材質(zhì)為聚二甲基硅氧烷。

26、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層的材質(zhì)為聚二甲基硅氧烷。

27、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，金屬微電極的材質(zhì)為鉑或金。

28、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，纖維支架-柔性微梁復(fù)合體的制備方法包括如下步驟：

29、(1)制備第一柔性層；

30、(2)通過磁控濺射在第一柔性層的表面制備金屬微電極陣列；

31、(3)在第一柔性層上通過激光切割形成若干微梁，得到設(shè)置有金屬微電極陣列的第一微梁結(jié)構(gòu)柔性層；

32、(4)在設(shè)置有金屬微電極陣列的第一微梁結(jié)構(gòu)柔性層的表面通過靜電噴霧制備第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層，并選擇性暴露金屬微電極陣列的檢測端與接口端，得到包括第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層的器件；

33、(5)在第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層上通過靜電紡絲制備有序纖維支架，得到纖維支架-柔性微梁復(fù)合體。

34、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，步驟(1)的具體操作為：將聚二甲基硅氧烷與固化劑混合得到聚合物溶液，然后置于模具中進(jìn)行固化，脫模后得到第一柔性層。在本實(shí)施例中，固化劑為含氫硅油，固化劑的添加量為10～15wt％，固化溫度為80～90℃，固化時(shí)間為30～40min。

35、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，步驟(2)的具體操作為：在第一柔性層表面覆蓋掩膜板，僅暴露出金屬微電極陣列所對應(yīng)的位置，然后將覆蓋有掩膜板的第一柔性層置于磁控濺射機(jī)內(nèi)進(jìn)行濺射，濺射功率為150w，濺射時(shí)間為20～60min，取下掩膜板，得到設(shè)置有金屬微電極陣列的第一柔性層。

36、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，步驟(3)的具體操作為：設(shè)計(jì)第一微梁結(jié)構(gòu)柔性層的圖紙，然后將該圖紙導(dǎo)入激光加工設(shè)備中并對設(shè)置有金屬微電極陣列的第一柔性層進(jìn)行激光切割。切割完成后，使用無水乙醇超聲清洗10～20min以去除表面切屑，得到設(shè)置有金屬微電極陣列的第一微梁結(jié)構(gòu)柔性層。

37、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，步驟(4)的具體操作為：

38、①用稀釋劑稀釋聚二甲基硅氧烷和固化劑混合而成的聚合物溶液；

39、②在設(shè)置有金屬微電極陣列的第一微梁結(jié)構(gòu)柔性層的表面覆蓋掩膜板，該掩膜板覆蓋住金屬微電極陣列的檢測端與接口端并暴露出第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層對應(yīng)的形狀；

40、③在噴霧針頭施加5～20kv的電壓，掩膜板接地，噴霧針頭與掩膜板的相對距離為10～30cm，稀釋過的聚合物溶液的推進(jìn)速度為100～500μl/h，噴霧時(shí)間為20～40min；

41、④將噴霧后的器件置于80～90℃中恒溫固化30～40min，然后取下掩膜板，得到包括第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層的器件。

42、在一些優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方式中，將纖維支架-柔性微梁復(fù)合體與培養(yǎng)腔不可逆鍵合的具體操作為：將纖維支架-柔性微梁復(fù)合體和兩個(gè)培養(yǎng)腔分別進(jìn)行等離子處理50～100s，然后定位貼合并置于40～50℃的恒溫箱中保溫30～60min，得到心肌細(xì)胞信號檢測平臺。

43、本發(fā)明至少具有如下有益效果：

44、1.本發(fā)明提供的心肌細(xì)胞信號檢測平臺在第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層上集成有序纖維支架，微梁的延伸方向與纖維絲的延伸方向垂直，模擬心肌細(xì)胞各向異性、富含豐富微納結(jié)構(gòu)的天然生長環(huán)境，使細(xì)胞懸空、有序生長，不受平面基底限制，適用于工程化心肌組織電生理信號的長期穩(wěn)定記錄。

45、2.本發(fā)明提供的纖維支架-柔性微梁復(fù)合的心肌細(xì)胞信號檢測平臺在聚二甲基硅氧烷柔性基底上通過鏤空處理形成微梁，得到第一微梁結(jié)構(gòu)柔性層和第二微梁結(jié)構(gòu)柔性層，生長于有序纖維支架上的細(xì)胞收縮后帶動(dòng)微梁發(fā)生撓度變化，微梁的存在對細(xì)胞收縮存在一定阻力，為心肌組織提供被動(dòng)機(jī)械激勵(lì)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)與功能成熟。