本發(fā)明屬于辣椒育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及一種辣椒果形基因 cafs1，及與該基因緊密相關(guān)的snp分子標(biāo)記及引物?(kasp)，同時(shí)還涉及它們?cè)陬A(yù)測(cè)辣椒果形變化及分子輔助育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、辣椒( capsicum?annuum?l.)為茄科辣椒屬，是中國(guó)最重要的蔬菜作物之一。果實(shí)是辣椒最主要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)出品。果實(shí)形狀是作物栽培馴化選擇過程中最主要的選擇性狀之一，辣椒野生種果實(shí)極小，但在馴化和改良過程中現(xiàn)代栽培辣椒的果實(shí)逐漸變大，且演變出豐富多樣的形狀。對(duì)于以鮮果為食用器官的辣椒等蔬菜作物，果實(shí)形狀更是重要的商品性狀，因?yàn)楣麑?shí)的形狀和大小不僅影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，還影響著消費(fèi)者的消費(fèi)偏好、包裝需求和市場(chǎng)價(jià)值。目前果實(shí)形狀仍是中國(guó)育種家在辣椒育種方案上非常關(guān)注的重要性狀。

2、辣椒果形性狀由數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative?trait?locus，qtl）調(diào)控，是分子標(biāo)記輔助育種（mas）的主要靶標(biāo)。雖然辣椒存在基因組大、遺傳連鎖圖譜分子標(biāo)記飽和度低，qtl基因挖掘費(fèi)時(shí)費(fèi)力問題，但辣椒基因組信息的完善及分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展極大地促進(jìn)了qtl克隆及功能分析。研究者通過自然群體或雜交群體已經(jīng)鑒定到許多辣椒果實(shí)相關(guān)qtls?位點(diǎn)。比如，鑒定到16個(gè)?snp?位點(diǎn)與果重關(guān)聯(lián)，其中7個(gè)snp位于已知果重基因上，如 stylosa、 fasciated、 wuschel和 clavata1等。在果肉厚度方面，鑒定到的qpt.iivr-2.1，qpt.iivr-3.1、ftd2.1等qtls?位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)?qtl?nlolg25.1與子房數(shù)相關(guān)。而在lcn1.1處鑒定到控制辣椒心室相關(guān)基因 cabrx，沉默 cabrx可以顯著減少心室數(shù)量，并且影響了花和心室相關(guān)基因的表達(dá)。fs3.1和?fs10.12被發(fā)現(xiàn)是果長(zhǎng)最強(qiáng)主效?qtls，分別能夠解釋67%和44%的遺傳效應(yīng)。盡管辣椒果實(shí)性狀研究雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些有關(guān)的基因qtl，但這些調(diào)控因子的作用模式仍然知之甚少，對(duì)于它們的應(yīng)用依舊是局限和低效的。

3、因此，探究辣椒重要農(nóng)藝性狀如果形的關(guān)鍵基因或qtl功能，并開發(fā)果形相關(guān)的分子標(biāo)記，對(duì)于辣椒分子育種技術(shù)體系的建立有著重要的推動(dòng)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服以上背景技術(shù)中提到的不足和缺陷，提供一種與辣椒果形基因 cafs1連鎖的snp分子標(biāo)記（kasp標(biāo)記）。為辣椒果實(shí)果形的篩選，鑒定和輔助篩選辣椒長(zhǎng)圓果實(shí)，以及辣椒果實(shí)果形的育種等提供新的途徑。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種與辣椒果實(shí)果形基因 cafs1連鎖的kasp分子標(biāo)記，以辣椒zunla-1的基因?yàn)閰⒖蓟?，在為辣?0號(hào)染色體上第14853470個(gè)堿基處的單核苷酸多態(tài)性，此處發(fā)生了堿基c到t的替換。

4、上述的與辣椒果實(shí)果形基因 cafs1連鎖的kasp分子標(biāo)記，優(yōu)選的，其核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

5、第二方面，本發(fā)明提供一種鑒定所述kasp分子標(biāo)記的引物，包括：

6、正向引物1：gaaggtgaccaagttcatgcttgttttaacagaaactggtgttttc；

7、正向引物2：gaaggtcggagtcaacggatttgttttaacagaaactggtgttttt；

8、反向引物：aaaaagtgctaacaggacatcacg。

9、兩個(gè)正向引物分別連接不同的熒光接頭序列，正向引物1中與fam熒光匹配的接頭序列為?gaaggtgaccaagttcatgct，正向引物2中與?hex熒光匹配的接頭序列為gaaggtcggagtcaacggatt。

10、第三方面，本發(fā)明提供一種所述kasp分子標(biāo)記的篩選方法，包括以下步驟：

11、（1）對(duì)辣椒材料進(jìn)行的重測(cè)序，根據(jù)重測(cè)序結(jié)果對(duì)辣椒果形性狀行進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，在此基礎(chǔ)上利用辣椒長(zhǎng)果的高代自交系為父本，辣椒圓果的高代自交系為母本，雜交構(gòu)建f2群體；

12、（2）對(duì)所述f2群體進(jìn)行果形表型鑒定，采用混池分離分析群體定位法分別獲得長(zhǎng)果混池和圓果混池，并進(jìn)行rna-seq測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析后獲得與辣椒果實(shí)果形連鎖的染色體候選區(qū)域；

13、（3）對(duì)所述染色體候選區(qū)域中的單堿基的替換/插入/缺失開發(fā)分子標(biāo)記技術(shù)縮小候選區(qū)間，最終獲得與果形基因 cafs1緊密連鎖的kasp分子標(biāo)記。

14、第四方面，本發(fā)明提供一種所述kasp分子標(biāo)記或所述的引物在鑒定辣椒長(zhǎng)果和圓果類型或分子輔助育種中的應(yīng)用。有利于辣椒果實(shí)果形基因的快速鑒定和選育，且為克隆控制果形的主效基因，為研究果實(shí)果形變化的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

15、上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，其應(yīng)用的方法如下：

16、s1：提取辣椒待測(cè)樣品dna作為模板；

17、s2：加入所述的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

18、s3：利用kasp試劑進(jìn)行分型，讀取分型結(jié)果，藍(lán)色為圓果顯性fam，綠色為長(zhǎng)果隱性hex，紅色為中間型果實(shí)雜合heterozygote。

19、優(yōu)選的，使用定量?pcr?設(shè)備進(jìn)行parms?pcr擴(kuò)增；熒光基團(tuán)和對(duì)應(yīng)熒光淬滅基團(tuán)距離較近時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光，會(huì)被淬滅基團(tuán)吸收，發(fā)射出更長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光，或者放出熱量。此時(shí)在此熒光對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)內(nèi)檢測(cè)不到該基團(tuán)熒光信號(hào)。一旦二者分離，則熒光信號(hào)可被檢測(cè)到。parms?采用了fret?原理來檢測(cè)?fam?以及?hex?熒光引物的擴(kuò)增信號(hào)，對(duì)應(yīng)的等位基因發(fā)生擴(kuò)增時(shí)，將出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)。

20、優(yōu)選的，pcr?擴(kuò)增程序?yàn)椋簆reincubation?94℃?900s;?94℃?20s，78℃?10s，td62℃，0?cyc-＞57?(-0℃)，10個(gè)循環(huán)；94℃?20s，57℃?60s，35個(gè)循環(huán)；cooling?37℃?30s。

21、第五方面，本發(fā)明提供一種辣椒果實(shí)果形基因 cafs1，其編碼區(qū)的cds核苷酸序列如seq?id?no：1所示。

22、第六方面，本發(fā)明提供一種辣椒果實(shí)果形基因 cafs1在調(diào)控辣椒或番茄果形中的應(yīng)用。

23、上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，在辣椒中沉默 cafs1基因，培育短小果形的辣椒品種。

24、優(yōu)選的，在番茄過表達(dá) cafs1基因，培育長(zhǎng)果番茄品種。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

26、1、本發(fā)明篩選到一個(gè)kasp分子標(biāo)記可以直接用于辣椒果實(shí)果形的鑒定，進(jìn)而依賴該分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種，能夠有效的解決常規(guī)育種周期長(zhǎng)，易受到環(huán)境影響的問題，在辣椒果實(shí)果形育種實(shí)踐及果形變化和調(diào)控機(jī)制研究上均具有重要意義；利用該標(biāo)記對(duì)f2群體90個(gè)隨機(jī)抽樣的單株進(jìn)行基因型鑒定，符合率達(dá)到100%，該結(jié)果不僅有助于辣椒果實(shí)果形鑒別及輔助育種，且為果形基因的圖位克隆及解析辣椒果形變化的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

27、2、通過早期利用該分子標(biāo)記可以快速篩選到滿意的植株，有效的減小了種植規(guī)模，減少了后期鑒定的工作量，提高了選擇的效率和準(zhǔn)確性，對(duì)研究果實(shí)顏色的形成機(jī)制具有重大的意義。