本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，尤其涉及一種基于咽拭子樣本的肺炎基因組檢測系統(tǒng)及方法。

背景技術(shù)：

1、近年來，基因組檢測技術(shù)的發(fā)展為病原體的快速識別提供了新的可能性，尤其是基于聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)和高通量測序(ngs)的基因組檢測方法，能夠在較短時間內(nèi)對多種病原體進(jìn)行同時檢測，這些技術(shù)不僅提高了檢測的靈敏度和特異性，還能夠識別常規(guī)培養(yǎng)方法無法檢測到的病原體，通過非侵入性的咽拭子采樣，獲取上呼吸道樣本，這樣能夠及時進(jìn)行樣本處理，以避免樣本降解，并通過采用優(yōu)化的提取試劑盒，從咽拭子樣本中快速提取病原體的基因組dna，通過提高提取效率和純度，確保后續(xù)pcr和測序的準(zhǔn)確性。同時，通過使用多重pcr技術(shù)，在同一次反應(yīng)中擴(kuò)增多種病原體的特定基因片段，該技術(shù)能夠在短時間內(nèi)識別出導(dǎo)致肺炎的常見病原體，包括細(xì)菌、病毒和真菌，大幅度提高檢測效率，并將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，以獲得全面的基因組信息，這樣通過生物信息學(xué)分析，快速識別病原體，并提供相應(yīng)的藥敏信息。然而，傳統(tǒng)的肺炎基因組檢測方法主要依賴于培養(yǎng)、血清學(xué)和影像學(xué)等手段，存在著準(zhǔn)確性不足以及對不同病原體的檢測能力有限的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本發(fā)明有必要提供一種基于咽拭子樣本的肺炎基因組檢測系統(tǒng)及方法，以解決至少一個上述技術(shù)問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，一種基于咽拭子樣本的肺炎基因組檢測方法，包括以下步驟：

3、步驟s1：獲取咽部咽拭子樣本溶液，并加入溶菌酶對咽部咽拭子樣本溶液內(nèi)的菌體進(jìn)行樣本消化，以得到無菌咽拭子樣本；通過將無菌咽拭子樣本放入含有rna/dna保護(hù)劑的核酸提取試劑盒中，并利用瓊脂糖凝膠電泳法對無菌咽拭子樣本對應(yīng)的核酸樣本進(jìn)行核酸質(zhì)量篩選處理，得到無菌咽拭子核酸高質(zhì)量樣本；

4、步驟s2：獲取肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列，并根據(jù)肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列進(jìn)行相關(guān)病原體引物設(shè)計(jì)，以獲取肺炎相關(guān)病原體特異性引物；利用肺炎相關(guān)病原體特異性引物以及連接酶對無菌咽拭子核酸高質(zhì)量樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增文庫構(gòu)建，得到咽拭子核酸pcr擴(kuò)增序列文庫；

5、步驟s3：對咽拭子核酸pcr擴(kuò)增序列文庫內(nèi)的每一組咽拭子核酸肺炎基因序列進(jìn)行高通量測序處理，以得到每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的高通量測序序列；

6、步驟s4：基于肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列對每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的高通量測序序列進(jìn)行基因組序列病原體比對檢測，得到咽拭子樣本肺炎病原體基因組檢測結(jié)果。

7、進(jìn)一步的，步驟s1包括以下步驟：

8、步驟s11：獲取咽部咽拭子初始樣本，并將咽部咽拭子初始樣本置入無菌試管中加入適量生理鹽水進(jìn)行充分搖勻，以得到咽部咽拭子樣本溶液；

9、步驟s12：對咽部咽拭子樣本溶液進(jìn)行光密度菌體濃度測定，得到咽拭子樣本溶液菌體濃度；

10、步驟s13：基于咽拭子樣本溶液菌體濃度對相對應(yīng)的咽部咽拭子樣本溶液進(jìn)行菌體消化條件優(yōu)化分析，以得到咽拭子樣本菌體最佳消化條件；

11、步驟s14：基于咽拭子樣本菌體最佳消化條件并加入溶菌酶對咽部咽拭子樣本溶液內(nèi)相對應(yīng)的菌體進(jìn)行樣本消化操作，以得到菌體消化后咽拭子樣本溶液；對菌體消化后咽拭子樣本溶液進(jìn)行無菌過濾與檢驗(yàn)，以得到無菌咽拭子樣本；

12、步驟s15：通過將無菌咽拭子樣本放入含有rna/dna保護(hù)劑的核酸提取試劑盒中，并利用瓊脂糖凝膠電泳法對無菌咽拭子樣本對應(yīng)的核酸樣本進(jìn)行核酸質(zhì)量篩選處理，得到無菌咽拭子核酸高質(zhì)量樣本。

13、進(jìn)一步的，步驟s12包括以下步驟：

14、步驟s121：利用分光光度計(jì)對咽部咽拭子樣本溶液進(jìn)行初步光學(xué)特性評估，以得到在不同波長下的咽拭子樣本光學(xué)特性數(shù)據(jù)集，其中咽拭子樣本光學(xué)特性數(shù)據(jù)集包括咽拭子樣本光學(xué)透光率以及咽拭子樣本光學(xué)吸光度值；

15、步驟s122：基于在不同波長下的咽拭子樣本光學(xué)特性數(shù)據(jù)集對相對應(yīng)的咽部咽拭子樣本溶液進(jìn)行波長選擇優(yōu)化分析，以得到咽拭子樣本溶液最佳測定波長參數(shù)；

16、步驟s123：基于咽拭子樣本溶液最佳測定波長參數(shù)利用分光光度計(jì)對相對應(yīng)的咽部咽拭子樣本溶液進(jìn)行光密度測定，得到咽拭子樣本溶液光密度測定結(jié)果；

17、步驟s124：獲取已知濃度標(biāo)準(zhǔn)菌體溶液，并基于咽拭子樣本溶液最佳測定波長參數(shù)對已知濃度標(biāo)準(zhǔn)菌體溶液進(jìn)行線性回歸分析與標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建，以得到咽拭子樣本光密度與菌體濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系數(shù)學(xué)模型；

18、步驟s125：根據(jù)咽拭子樣本光密度與菌體濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系數(shù)學(xué)模型對咽拭子樣本溶液光密度測定結(jié)果進(jìn)行菌體濃度反推計(jì)算，得到咽拭子樣本溶液菌體濃度。

19、進(jìn)一步的，步驟s15包括以下步驟：

20、步驟s151：對無菌咽拭子樣本進(jìn)行冷鏈保存活性恢復(fù)處理，得到無菌咽拭子活性恢復(fù)樣本；

21、步驟s152：通過將無菌咽拭子活性恢復(fù)樣本放入含有rna/dna保護(hù)劑的核酸提取試劑盒中進(jìn)行樣本稀釋處理，得到無菌咽拭子核酸提取溶液體系；

22、步驟s153：對無菌咽拭子核酸提取溶液體系進(jìn)行離心分離處理，得到無菌咽拭子初步核酸提取液；

23、步驟s154：利用瓊脂糖凝膠電泳法對無菌咽拭子初步核酸提取液內(nèi)相對應(yīng)的核酸樣本進(jìn)行核酸質(zhì)量電泳分析，以得到每一個無菌咽拭子核酸樣本對應(yīng)的核酸片段質(zhì)量圖譜；

24、步驟s155：基于每一個無菌咽拭子核酸樣本對應(yīng)的核酸片段質(zhì)量圖譜對無菌咽拭子初步核酸提取液內(nèi)相對應(yīng)的核酸樣本進(jìn)行核酸質(zhì)量篩選處理，得到無菌咽拭子核酸高質(zhì)量樣本。

25、進(jìn)一步的，步驟s155包括以下步驟：

26、對每一個無菌咽拭子核酸樣本對應(yīng)的核酸片段質(zhì)量圖譜進(jìn)行核酸片段大小及帶型清晰度提取處理，得到每一個無菌咽拭子核酸樣本對應(yīng)的核酸片段大小以及核酸片段帶型清晰度；

27、基于每一個無菌咽拭子核酸樣本對應(yīng)的核酸片段大小以及核酸片段帶型清晰度利用核酸片段分子量截留計(jì)算公式對相對應(yīng)的核酸片段質(zhì)量圖譜進(jìn)行分子量截留量化計(jì)算，得到無菌咽拭子核酸片段分子量截留值；

28、基于無菌咽拭子核酸片段分子量截留值利用膜過濾技術(shù)對無菌咽拭子初步核酸提取液內(nèi)相對應(yīng)的核酸樣本進(jìn)行核酸質(zhì)量篩選處理，得到無菌咽拭子核酸高質(zhì)量樣本。

29、進(jìn)一步的，所述核酸片段分子量截留計(jì)算公式具體為：

30、

31、式中，mr為無菌咽拭子核酸片段分子量截留值，vt為無菌咽拭子核酸樣本總體積，l為無菌咽拭子核酸樣本對應(yīng)的核酸片段大小，c(x)為無菌咽拭子核酸樣本在位置x處的核酸片段帶型清晰度，mp(x)為無菌咽拭子核酸樣本在位置x處的核酸片段分子量，mm為無菌咽拭子核酸樣本參考分子量，α為核酸片段分子量影響指數(shù)，β為核酸片段分子量衰減系數(shù)，lc為核酸片段位置尺寸標(biāo)準(zhǔn)閾值，η為無菌咽拭子核酸片段分子量截留值的修正系數(shù)。

32、進(jìn)一步的，步驟s2包括以下步驟：

33、步驟s21：獲取肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列；

34、步驟s22：對肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)性收集及整理，得到肺炎相關(guān)病原體歷史基因組數(shù)據(jù)庫；

35、步驟s23：基于肺炎相關(guān)病原體歷史基因組數(shù)據(jù)庫對不同的肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列進(jìn)行序列比對與保守區(qū)域識別分析，得到肺炎相關(guān)病原體歷史基因組保守區(qū)段；

36、步驟s24：基于肺炎相關(guān)病原體歷史基因組保守區(qū)段對相對應(yīng)的肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列進(jìn)行相關(guān)病原體引物設(shè)計(jì)，以獲取肺炎相關(guān)病原體特異性引物；

37、步驟s25：對肺炎相關(guān)病原體特異性引物進(jìn)行引物復(fù)性pcr反應(yīng)條件設(shè)定，以得到肺炎相關(guān)病原體引物pcr反應(yīng)體系條件；基于肺炎相關(guān)病原體引物pcr反應(yīng)體系條件對無菌咽拭子核酸高質(zhì)量樣本進(jìn)行核酸pcr擴(kuò)增反應(yīng)處理，得到咽拭子樣本核酸pcr擴(kuò)增序列片段；利用連接酶對咽拭子樣本核酸pcr擴(kuò)增序列片段進(jìn)行文庫連接構(gòu)建，得到咽拭子核酸pcr擴(kuò)增序列文庫。

38、進(jìn)一步的，步驟s3包括以下步驟：

39、步驟s31：對咽拭子核酸pcr擴(kuò)增序列文庫內(nèi)的每一組咽拭子核酸肺炎基因序列進(jìn)行基因條帶分離切取處理，得到每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的基因序列目標(biāo)條帶；

40、步驟s32：對每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的基因序列目標(biāo)條帶進(jìn)行基因序列特性分析，得到每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的基因序列特性數(shù)據(jù)；

41、步驟s33：基于每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的基因序列特性數(shù)據(jù)對相對應(yīng)的基因序列目標(biāo)條帶進(jìn)行測序反應(yīng)條件設(shè)定，以生成每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的基因測序反應(yīng)條件體系；

42、步驟s34：根據(jù)每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的基因測序反應(yīng)條件體系對咽拭子核酸pcr擴(kuò)增序列文庫內(nèi)的每一組咽拭子核酸肺炎基因序列進(jìn)行高通量測序處理，以得到每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的高通量測序序列。

43、進(jìn)一步的，步驟s4包括以下步驟：

44、步驟s41：對每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的高通量測序序列進(jìn)行序列質(zhì)控預(yù)處理，得到每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)測序序列；

45、步驟s42：對肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列以及每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)測序序列進(jìn)行基因序列生物特征分析，得到肺炎相關(guān)病原體歷史基因序列生物特征以及每一組咽拭子核酸肺炎基因序列生物特征；

46、步驟s43：利用序列相似性比對計(jì)算公式對肺炎相關(guān)病原體歷史基因序列生物特征以及每一組咽拭子核酸肺炎基因序列生物特征進(jìn)行序列相似比對計(jì)算，以得到每一組咽拭子肺炎基因與相關(guān)病原體歷史基因之間的序列相似比對值；

47、其中，序列相似性比對計(jì)算公式具體為：

48、

49、式中，s(a,b)為咽拭子肺炎基因與相關(guān)病原體歷史基因之間的序列相似比對值，a為肺炎相關(guān)病原體歷史基因序列，b為咽拭子核酸肺炎基因序列，n為肺炎相關(guān)病原體歷史基因序列內(nèi)生物子特征的總數(shù)量，i為歷史基因序列生物子特征的項(xiàng)次度量參數(shù)，m為咽拭子核酸肺炎基因序列內(nèi)生物子特征的總數(shù)量，j為咽拭子核酸肺炎基因序列生物子特征的項(xiàng)次度量參數(shù)，ai為肺炎相關(guān)病原體歷史基因序列內(nèi)的第i個生物子特征，bj為咽拭子核酸肺炎基因序列內(nèi)的第j個生物子特征，f(ai,bj)為肺炎相關(guān)病原體歷史基因序列內(nèi)第i個生物子特征與咽拭子核酸肺炎基因序列內(nèi)第j個生物子特征之間的特征相似性距離值，δ1為特征相似性距離權(quán)重參數(shù)，g(ai,bj)為肺炎相關(guān)病原體歷史基因序列內(nèi)第i個生物子特征與咽拭子核酸肺炎基因序列內(nèi)第j個生物子特征之間的額外物理化學(xué)特征相似貢獻(xiàn)值，δ2為額外特征相似貢獻(xiàn)權(quán)重參數(shù)，p(ai)為肺炎相關(guān)病原體歷史基因序列內(nèi)第i個生物子特征的物理化學(xué)特性參數(shù)，p(bj)為咽拭子核酸肺炎基因序列內(nèi)第j個生物子特征的物理化學(xué)特性參數(shù)，gap(a,b)為肺炎相關(guān)病原體歷史基因序列a與咽拭子核酸肺炎基因序列b之間的序列比對缺口數(shù)，λ為缺口懲罰系數(shù)；

50、步驟s44：基于每一組咽拭子肺炎基因與相關(guān)病原體歷史基因之間的序列相似比對值對每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的高通量測序序列進(jìn)行病原體比對檢測，得到咽拭子樣本肺炎病原體基因組檢測結(jié)果。

51、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種基于咽拭子樣本的肺炎基因組檢測系統(tǒng)，用于執(zhí)行如上所述的基于咽拭子樣本的肺炎基因組檢測方法，該基于咽拭子樣本的肺炎基因組檢測系統(tǒng)包括：

52、無菌咽拭子核酸樣本篩選模塊，用于獲取咽部咽拭子樣本溶液，并加入溶菌酶對咽部咽拭子樣本溶液內(nèi)的菌體進(jìn)行樣本消化，以得到無菌咽拭子樣本；通過將無菌咽拭子樣本放入含有rna/dna保護(hù)劑的核酸提取試劑盒中，并利用瓊脂糖凝膠電泳法對無菌咽拭子樣本對應(yīng)的核酸樣本進(jìn)行核酸質(zhì)量篩選處理，從而得到無菌咽拭子核酸高質(zhì)量樣本；

53、咽拭子核酸序列文庫擴(kuò)增模塊，用于獲取肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列，并根據(jù)肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列進(jìn)行相關(guān)病原體引物設(shè)計(jì)，以獲取肺炎相關(guān)病原體特異性引物；利用肺炎相關(guān)病原體特異性引物以及連接酶對無菌咽拭子核酸高質(zhì)量樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增文庫構(gòu)建，從而得到咽拭子核酸pcr擴(kuò)增序列文庫；

54、咽拭子核酸肺炎基因組測序模塊，用于對咽拭子核酸pcr擴(kuò)增序列文庫內(nèi)的每一組咽拭子核酸肺炎基因序列進(jìn)行高通量測序處理，以得到每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的高通量測序序列；

55、咽拭子肺炎基因組比對檢測模塊，用于基于肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列對每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的高通量測序序列進(jìn)行基因組序列病原體比對檢測，從而得到咽拭子樣本肺炎病原體基因組檢測結(jié)果。

56、本發(fā)明的有益效果：

57、1、本發(fā)明所提出的基于咽拭子樣本的肺炎基因組檢測方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)的有益效果在于通過獲取咽部咽拭子樣本溶液，并加入溶菌酶對咽部咽拭子樣本溶液內(nèi)的菌體進(jìn)行樣本消化，能夠有效地裂解咽拭子樣本溶液內(nèi)原有細(xì)菌的細(xì)胞壁，從而消除咽拭子樣本溶液內(nèi)原本存在的細(xì)菌，還通過對菌體消化后的咽拭子樣本溶液進(jìn)行無菌過濾與檢驗(yàn)，無菌過濾是進(jìn)一步保證樣本純凈的重要步驟，通過去除未消化的細(xì)菌和細(xì)胞殘骸，可以得到更加清澈的樣本，這不僅減少了后續(xù)分析中的干擾，還能夠有效提高核酸提取的純度，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。同時，通過將無菌咽拭子樣本放入含有rna/dna保護(hù)劑的核酸提取試劑盒中，保護(hù)劑可以有效防止核酸在提取過程中的降解，確保提取結(jié)果的高質(zhì)量，并通過利用瓊脂糖凝膠電泳法對無菌咽拭子樣本對應(yīng)的核酸樣本進(jìn)行核酸質(zhì)量篩選處理，可以直觀地觀察到核酸的完整性和純度，這一步驟不僅幫助確認(rèn)提取的核酸是否符合后續(xù)應(yīng)用過程的要求，同時也為科研人員提供了一個可視化的數(shù)據(jù)支持，方便進(jìn)行比較和分析。其次，通過獲取肺炎相關(guān)病原體的歷史基因組序列，這樣通過公共數(shù)據(jù)庫(如ncbi、ebi)收集肺炎歷史相關(guān)病原體相對應(yīng)的歷史基因組序列，能夠深入分析不同病原體的基因組特征，這種系統(tǒng)性的收集不僅有助于構(gòu)建病原體的基因組信息圖譜，也為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通過根據(jù)肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列進(jìn)行相關(guān)病原體引物設(shè)計(jì)，這一步驟可以確保引物在不同病原體間的特異性，從而提高pcr擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和靈敏度，這不僅優(yōu)化了檢測流程，還增強(qiáng)了后續(xù)處理過程的可靠性，引物設(shè)計(jì)的成功與否直接影響到后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量，精確的引物能夠顯著減少非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險。通過利用肺炎相關(guān)病原體特異性引物以及連接酶對無菌咽拭子核酸高質(zhì)量樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增文庫構(gòu)建，能夠?qū)⑻囟ǖ暮怂崞握线M(jìn)文庫中，以便后續(xù)的測序和分析，這一步驟是基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中不可或缺的環(huán)節(jié)，成功構(gòu)建的文庫能夠提供豐富的遺傳信息，助力后續(xù)的高通量測序，文庫的構(gòu)建不僅提高了樣本的可利用性，還使得多樣本、多時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)分析成為可能，從而提升了對病原體的監(jiān)測和分析能力，這一環(huán)節(jié)能夠?yàn)槿胬斫夥窝紫嚓P(guān)病原體提供了重要的工具和數(shù)據(jù)支持。然后，通過對咽拭子核酸pcr擴(kuò)增序列文庫內(nèi)的每一組咽拭子核酸肺炎基因序列進(jìn)行高通量測序處理，這一步驟通過應(yīng)用先進(jìn)的測序技術(shù)，可以同時對成千上萬的dna片段進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的測序，這一過程的關(guān)鍵在于它極大地提升了測序的通量和效率，使得大規(guī)模樣本的基因組研究變得可行，還能夠提供了豐富的基因組數(shù)據(jù)，有助于全面理解與肺炎等疾病相關(guān)病原體的基因組特征，從而加速肺炎基因組研究的進(jìn)展和成果的轉(zhuǎn)化。最后，通過基于肺炎相關(guān)病原體歷史基因組序列對每一組咽拭子核酸肺炎基因?qū)?yīng)的高通量測序序列進(jìn)行基因組序列病原體比對檢測，這一過程能夠?qū)⒏咄繙y序得到的標(biāo)準(zhǔn)序列與數(shù)據(jù)庫中已知的病原體基因組進(jìn)行比較，識別潛在的感染病原體，通過計(jì)算比對值，可以獲得關(guān)于樣本中病原體的定量信息，幫助判斷其相對豐度和流行特征，可以顯著提高對肺炎病原體的檢測能力和識別準(zhǔn)確性，推動相關(guān)研究的深入發(fā)展。

58、2、本發(fā)明所提出的基于咽拭子樣本的肺炎基因組檢測系統(tǒng)，整體上由無菌咽拭子核酸樣本篩選模塊、咽拭子核酸序列文庫擴(kuò)增模塊、咽拭子核酸肺炎基因組測序模塊以及咽拭子肺炎基因組比對檢測模塊組成，能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明所述基于咽拭子樣本的肺炎基因組檢測方法，用于聯(lián)合各個模塊上運(yùn)行的計(jì)算機(jī)程序之間的操作實(shí)現(xiàn)基于咽拭子樣本的肺炎基因組檢測方法，系統(tǒng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)互相協(xié)作，這樣能夠大大減少重復(fù)工作和人力投入，能夠快速有效地提供更為準(zhǔn)確、更高效的基于咽拭子樣本的肺炎基因組檢測過程，從而簡化了基于咽拭子樣本的肺炎基因組檢測系統(tǒng)的操作流程。