本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種抗cd27l的全人源抗體或抗體片段及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、cd27l(又稱為tnfsf7、cd70或cd27lg等)，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員(tumor?necrosis?factor?receptor?super?family)，是一種廣泛報道的t、b細胞免疫共刺激分子。編碼人cd27l的基因位于染色體19p13.2-13.3區(qū)域，其成熟的蛋白大小約為50kda，是一種以三聚體形式存在的ii型跨膜糖基化蛋白。全長的cd27l蛋白含193個氨基酸，包括胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)、跨膜區(qū)(tm)、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(icd)和兩個n端糖基化序列；其ecd的第1和第3個、第2和第4個半胱氨酸，各自形成二硫鍵，從而維持特定的空間構(gòu)象。cd27l在動物疾病模型中有廣泛應(yīng)用，但其在人類和小鼠之間有較大差異，兩者的相似性只有約56％。

2、cd27l主要表達在特定的免疫細胞上，包括樹突狀細胞、活化的淋巴細胞、扁桃體、皮膚和腸道中的t細胞、腸道固有層的抗原遞呈細胞等。cd27l在淋巴細胞上的表達是極短暫的，主要存在于活化的t、b和nk細胞上，比如產(chǎn)生ifn-γ的t細胞基本是cd27l+，分泌免疫球蛋白的被抗原激活的b細胞等。這種高度限制和時間調(diào)節(jié)的表達模式，是由共刺激信號、細胞激活信號、抗原刺激和細胞因子精心介導(dǎo)，從而精確、嚴格調(diào)控cd27l發(fā)揮其生物功能的時機。病理情況下，cd27l高表達于多種腫瘤組織，包括多種淋巴惡性腫瘤、胰腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤等；而在正常組織中，cd27l僅在活化的免疫細胞上限制性表達，且表達水平較低，這使得cd27l成為免疫治療的一個理想靶點。

3、已知cd27l與其唯一的受體cd27相結(jié)合，這是屬于腫瘤壞死因子受體超家族(tnfr)的成員，是由兩個分子量約為55kda的單體經(jīng)二硫鍵連接形成的同型二聚體跨膜糖蛋白。對腫瘤種cd27l-cd27信號傳導(dǎo)的研究，顯示其信號傳導(dǎo)能誘導(dǎo)惡性細胞增殖。cd27l-cd27共刺激，能使胸腺中發(fā)育的treg細胞免于死亡，增加腫瘤小鼠脾臟和淋巴結(jié)中treg的數(shù)量，促進t細胞分化。cd27l-cd27信號的缺失，可抑制后肢缺血小鼠模型側(cè)支循環(huán)的發(fā)生。同時，也有研究表明cd27l-cd27共刺激信號參與了cd4+t細胞介導(dǎo)的自身免疫病。因此，cd27l-cd27相互作用，對調(diào)節(jié)細胞免疫反應(yīng)至關(guān)重要。除此之外，cd27l作為一種b細胞共刺激分子，其在b-t細胞接觸中，與cd27相互作用促進b細胞分化為漿細胞，從而使免疫球蛋白的生成增多，并且增加活化的自然殺傷細胞的毒性作用。許多證據(jù)表明cd27l在不同類型的腫瘤(比如淋巴瘤、實體腫瘤)、自身免疫性疾病(比如紅斑狼瘡)中起著重要作用。在某些腫瘤細胞中，cd27l的過度表達可以幫助腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。

4、綜上所述，基于cd27l-cd27的這些腫瘤促進和免疫抑制作用機制的發(fā)現(xiàn)，以及cd27在處于穩(wěn)態(tài)期的免疫細胞上持續(xù)表達而cd27l不表達的特點，使得我們可以開發(fā)靶向cd27l的阻斷抗體，從而治療相關(guān)疾病。其主要有以下幾種途徑：(1)通過干擾cd27l與cd27之間的信號傳遞，從而減弱t細胞的激活和增殖；(2)阻斷cd27l/cd27信號通路，降低t細胞的過度激活；(3)誘導(dǎo)抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性(adcc)；(4)抗體介導(dǎo)的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)干擾，這種干擾可以影響腫瘤細胞的生存、增殖和遷移，從而抑制腫瘤的生長和擴散。

5、目前已有多種靶向cd27l的療法在臨床前及臨床研究中取得進展，如abbvie公司目前正在臨床試驗階段的cd27l單克隆抗體abbv181。通過結(jié)合cd27l，abbv181阻斷cd27l與cd27的相互作用，抑制腫瘤細胞的增殖和生存。cusatuzumab(argx-110)等藥物通過攜帶fc受體(fcγriii)，基于抗體依賴性細胞毒性(adcc)作用，激活免疫效應(yīng)細胞并阻斷靶蛋白，已被證實可以有效消除接受低甲基化藥物治療的aml患者的白血病干細胞(lsc)，同時阻斷cd27l-cd27通路所誘導(dǎo)的aml原始細胞和干/祖細胞分化。此外，一些靶向cd27l的car-t細胞療法正在血液腫瘤和實體惡性腫瘤患者中進行i/ii期臨床試驗評估。

6、盡管cd27l在治療和診斷中顯示出巨大的潛力，但也面臨一些挑戰(zhàn)。如需要確保抗體對cd27l的高特異性，避免對正常細胞的非特異性結(jié)合；此外，目前大多數(shù)cd27l抗體不能交叉結(jié)合不同物種的cd27l蛋白，使體內(nèi)活性研究和安全性評價分析等需要開發(fā)不同的抗體，研究成本較高，也無法在不同物種之間進行橫向比較免疫學(xué)研究。因此，進一步探索和開發(fā)新的靶向cd27l的抗體，為與之相關(guān)的臨床研究及應(yīng)用提供新的可能，對于提高腫瘤治療的有效性和安全性具有積極意義，同時也為患者提供更多的治療選擇。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、(一)要解決的技術(shù)問題

2、鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點、不足，本發(fā)明提供交叉結(jié)合人、食蟹猴和小鼠的cd27l蛋白且具備對cd27l/cd27的阻斷活性的抗cd27l的全人源抗體及其應(yīng)用，該抗體能特異性交叉結(jié)合人、食蟹猴和小鼠的cd27l蛋白，有利于開展動物模型體內(nèi)活性研究，提高試驗靈活性和效率，對加速新藥研發(fā)進程具有重要意義。

3、(二)技術(shù)方案

4、第一方面，本發(fā)明提供一種抗cd27l的全人源抗體或抗體片段，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)的三個互補決定區(qū)cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的氨基酸序列分別如seq?id?no.1-3所示，所述輕鏈可變區(qū)的三個互補決定區(qū)cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的氨基酸序列分別如seq?id?no.5、7、9所示；或者

5、所述重鏈可變區(qū)的三個互補決定區(qū)cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的氨基酸序列分別如seq?id?no.1-2及4所示，所述輕鏈可變區(qū)的三個互補決定區(qū)cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的氨基酸序列分別如seq?id?no.6、8、10所示。

6、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，所述重鏈可變區(qū)具有seq?id?no.11所示的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)具有seq?id?no.13所示的氨基酸序列；或者，所述重鏈可變區(qū)具有seqid?no.12所示的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)具有seq?id?no.14所示的氨基酸序列。

7、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，所述全人源抗體或抗體片段具有seq?id?no.29或seqid?no.30所示的氨基酸序列。

8、第二方面，本發(fā)明提供一種編碼上述抗cd27l的全人源抗體或抗體片段的多核苷酸。

9、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，所述多核苷酸包括編碼重鏈可變區(qū)的基因片段和編碼輕鏈可變區(qū)的基因片段，所述編碼重鏈可變區(qū)的基因片段具有seq?id?no.15-17所示的堿基序列，所述編碼輕鏈可變區(qū)的基因片段具有seq?id?no.19、21、23所示的基因序列；或者，所述編碼重鏈可變區(qū)的基因片段具有seq?id?no.15-16及18所示的堿基序列，所述編碼輕鏈可變區(qū)的基因片段如seq?id?no.20、22、24所示的堿基序列。

10、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，所述多核苷酸包括編碼重鏈可變區(qū)的基因片段和編碼輕鏈可變區(qū)的基因片段，所述編碼重鏈可變區(qū)的基因片段具有seq?id?no.25所示的堿基序列，所述編碼輕鏈可變區(qū)的基因片段具有seq?id?no.27所示的堿基序列；或者，所述編碼重鏈可變區(qū)的基因片段具有seq?id?no.26所示的堿基序列，所述編碼輕鏈可變區(qū)的基因片段具有seq?id?no.28所示的堿基序列。

11、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，所述多核苷酸具有如seq?id?no.31或seq?id?no.32所示的堿基序列。

12、第三方面，本發(fā)明還提供一種包含上述多核苷酸的表達載體或細胞。

13、第四方面，本發(fā)明涉及所述抗cd27l的全人源抗體或抗體片段在制備檢測試劑盒、抗體芯片、抗體探針或抗腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。

14、本技術(shù)中，抗cd27l的全人源抗體的抗體片段包括fab、f(ab’)2、fab′、scfv等。其中，fab包括一個完整的輕鏈和重鏈的可變區(qū)及第一個恒定區(qū)。fab片段保留了單個抗原結(jié)合位點。f(ab’)2由兩個fab片段通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接而成，具有雙價結(jié)合能力，可以同時結(jié)合兩個相同的抗原表位。scfv由vh和vl通過一段柔性肽鏈連接而成的單鏈形式，保持了抗原結(jié)合能力?？筩d27l的全人源抗體是一個完整的免疫球蛋白分子，而抗體片段通常是指抗體的一部分，它僅包含能夠結(jié)合抗原的區(qū)域，可以是通過酶解或其他方法從完整抗體中分離出來的片段。在某些情況下，使用抗體片段而不是整個抗體可能是有利的，例如為了減少非特異性結(jié)合或提高組織穿透力。

15、(三)有益效果

16、本發(fā)明篩選的抗cd27l的全人源抗體，通過完全人源化的方式產(chǎn)生，具有極低免疫原性的風(fēng)險。所述抗體還具有良好的結(jié)合跨種屬靶分子(人、食蟹猴和小鼠)的能力，有利于后續(xù)在小鼠或食蟹猴腫瘤模型中進行體內(nèi)活性研究及安全性評價分析，提高了研究性試驗的靈活性和效率，對加速新藥研發(fā)進程具有重要意義。實驗證實，所述抗cd27l的全人源抗體能有效阻斷cd27l與cd27的相互作用，進而抑制腫瘤細胞的增殖和生存。此外，實驗還證實，本發(fā)明的抗cd27l的全人源抗體具有良好的蛋白靶點和細胞靶點的結(jié)合活性(親和力高)，其與蛋白靶點和細胞靶點的結(jié)合的ec50值以及阻斷cd27l/cd27的ic50值均低至pm級別，因此本發(fā)明提供的抗體或抗體片段在開發(fā)靶向cd27l的抗體藥物方向有良好的應(yīng)用前景。