本發(fā)明屬于基因編輯和檢測(cè)，具體涉及一種來(lái)源于單子葉植物水稻的argonaute蛋白質(zhì)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、argonaute（ago）蛋白家族成員廣泛存在于生物體內(nèi)，根據(jù)來(lái)源可分為真核argonaute（eago）和原核argonaute（pago）。eagos在生物體內(nèi)rna干擾途徑中起重要作用，是rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物risc的功能核心，在介導(dǎo)引導(dǎo)鏈和靶互補(bǔ)配對(duì)過(guò)程中發(fā)揮生物支架的作用，可通過(guò)eagos自身核酸酶的活性切割互補(bǔ)靶標(biāo)或招募其他蛋白分子作用于靶標(biāo)。eagos通過(guò)靶向裂解rna、抑制mrna翻譯、dna甲基化等方式調(diào)控基因的表達(dá)，參與dna修復(fù)以及減少轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)性來(lái)保持基因組的完整性等過(guò)程，在生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、抵御病原體、應(yīng)對(duì)脅迫等領(lǐng)域發(fā)揮重要功能。

2、目前，pagos在體內(nèi)的生理功能尚不如eagos清楚，并且真核生物中缺乏pagos活性的報(bào)道，可能是因?yàn)轶w內(nèi)難以形成有效的pago-向?qū)Ш怂釓?fù)合物。eagos在體外大多數(shù)具有特異性切割rna的活性，但對(duì)dna的特異性切割活性少見報(bào)道。

3、eagos在遺傳進(jìn)化的分類和酶學(xué)上有很大的多樣性。目前研究核酸酶切性質(zhì)的eagos主要來(lái)源于單細(xì)胞的真核微生物，對(duì)于多細(xì)胞組成的動(dòng)植物來(lái)源的eagos主要研究體內(nèi)的生理功能，對(duì)于體外的生化性質(zhì)比如與dna的相互作用沒(méi)有詳細(xì)的研究，目前并未有利用動(dòng)植物eagos進(jìn)行基因編輯、修飾和分子檢測(cè)等應(yīng)用。因此，表征來(lái)源于多細(xì)胞生物的eagos，有望提供更多應(yīng)用于動(dòng)植物體內(nèi)的核酸操縱工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明旨在從多細(xì)胞真核生物中挖掘一種能夠用于基因編輯、修飾和分子檢測(cè)等領(lǐng)域的eago，并明確其具體應(yīng)用方案，為復(fù)雜條件下分子檢測(cè)和動(dòng)植物基因編輯、修飾提供一種新的可選的分子工具。

2、本發(fā)明第一方面公開了一種植物來(lái)源的argonaute蛋白質(zhì)及其與向?qū)Ш怂嵝纬傻膹?fù)合物在核酸編輯和檢測(cè)中的應(yīng)用，其中argonaute蛋白質(zhì)來(lái)源于單子葉模式生物水稻，具體為：

3、氨基酸序列如seq?id?no.1所示的蛋白質(zhì)；或，

4、與seq?id?no.1所示氨基酸序列具有至少80%同源性序列，優(yōu)選具有至少90%同源性序列，更優(yōu)選具有至少95%同源性序列，且具有相應(yīng)功能的蛋白質(zhì)。

5、在上述應(yīng)用中，argonaute蛋白質(zhì)在向?qū)Ш怂峤閷?dǎo)下特異性切割靶核酸，其中向?qū)Ш怂釣橄驅(qū)na或/和向?qū)na，靶核酸為dna靶或/和rna靶，且靶核酸中含有與向?qū)Ш怂峄パa(bǔ)配對(duì)的序列。其中，rna靶沒(méi)有高級(jí)結(jié)構(gòu)，或有高級(jí)結(jié)構(gòu)，或?yàn)殡p鏈rna，或?yàn)轶w外轉(zhuǎn)錄的rna，或?yàn)椴《净蚪Mrna，或?yàn)閙rna，或細(xì)胞內(nèi)的其他rna；dna靶為合成的單鏈dna，或?yàn)殡p鏈dna，或?yàn)橘|(zhì)粒dna；可以是細(xì)胞基因組dna，還可以是細(xì)胞內(nèi)的其他dna。

6、可以理解的是，本發(fā)明所用的argonaute蛋白質(zhì)可以是天然提取獲得，也可以通過(guò)異源表達(dá)獲得。而且，編碼本發(fā)明argonaute蛋白質(zhì)的核酸分子的序列如seq?id?no.2所示或與seq?id?no.2所示序列具有至少80%的同源性。

7、優(yōu)選地，在上述應(yīng)用中，向?qū)na的長(zhǎng)度為10-40?nt；其中，本發(fā)明argonaute蛋白質(zhì)在向?qū)na介導(dǎo)下切割dna靶時(shí)最佳長(zhǎng)度為13?nt，在向?qū)na介導(dǎo)下切割rna靶時(shí)最佳長(zhǎng)度為15?nt。

8、優(yōu)選地，在上述應(yīng)用中，向?qū)na的長(zhǎng)度為12-40?nt；其中，本發(fā)明argonaute蛋白質(zhì)在向?qū)na介導(dǎo)下切割dna靶時(shí)最佳長(zhǎng)度為19?nt，在向?qū)na介導(dǎo)下切割rna靶時(shí)最佳長(zhǎng)度為18?nt。

9、優(yōu)選地，在上述應(yīng)用中，向?qū)Ш怂岬?’端具有磷酸化修飾。

10、優(yōu)選地，在上述應(yīng)用中，向?qū)na的5’端第一個(gè)核苷酸為胸腺嘧啶（t），向?qū)na的5’端第一個(gè)核苷酸為尿嘧啶（u）。

11、在上述應(yīng)用中，argonaute蛋白質(zhì)與向?qū)Ш怂嵝纬傻膹?fù)合物在25-60℃下具有切割靶核酸的活性。具體地，當(dāng)靶核酸為dna靶時(shí)，切割位點(diǎn)在與dna靶互補(bǔ)配對(duì)的向?qū)Ш怂岬?’端到3’端的第10到11位堿基之間；當(dāng)靶核酸為rna靶時(shí)，切割位點(diǎn)在與rna靶互補(bǔ)配對(duì)的向?qū)Ш怂岬?’端到3’端的第9到10位堿基之間。

12、優(yōu)選地，在上述應(yīng)用中，argonaute蛋白質(zhì)與向?qū)Ш怂嵝纬傻膹?fù)合物在41-60℃下切割靶核酸。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在向?qū)na介導(dǎo)下，argonaute蛋白質(zhì)可以在25-45℃有效切割dna靶，其中41℃最佳；在向?qū)na介導(dǎo)下，argonaute蛋白質(zhì)可以在25-55℃有效切割dna靶，其中50℃最佳；切割rna靶時(shí)，向?qū)na或向?qū)na可以在25-60℃有效切割rna靶標(biāo)，其中45℃最佳。

13、優(yōu)選地，在上述應(yīng)用中，靶核酸中含有與向?qū)Ш怂峄パa(bǔ)配對(duì)的序列，具體為：

14、向?qū)Ш怂峋哂信c所述靶核酸完全互補(bǔ)的核苷酸序列；或，

15、向?qū)Ш怂峋哂信c靶核酸存在單堿基或雙堿基錯(cuò)配的核苷酸序列，其中單堿基錯(cuò)配不發(fā)生在向?qū)Ш怂岬?’端第一位核苷酸處。

16、另外，可以理解的是，本發(fā)明中argonaute蛋白質(zhì)在向?qū)Ш怂峤閷?dǎo)下特異性切割靶核酸包括以下情形：

17、argonaute蛋白質(zhì)在體外切割靶核酸，其應(yīng)用過(guò)程可為：將argonaute蛋白質(zhì)與向?qū)Ш怂岱跤纬蒭ago復(fù)合物，eago復(fù)合物與靶核酸接觸，且靶核酸存在與向?qū)Ш怂嵝蛄谢パa(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，故argonaute蛋白質(zhì)在特定位點(diǎn)切割靶標(biāo)。

18、argonaute蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)切割靶核酸時(shí)，其應(yīng)用過(guò)程可為：將argonaute蛋白質(zhì)與向?qū)Ш怂岱跤纬蒭ago復(fù)合物，或?qū)⒑邢驅(qū)Ш怂岷蚢rgonaute蛋白質(zhì)基因的載體，通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式導(dǎo)入植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，進(jìn)而通過(guò)靶向切割作用進(jìn)行細(xì)胞表達(dá)調(diào)控。

19、本發(fā)明第二方面提供了一種核酸切割體系，其至少包括：

20、argonaute蛋白質(zhì)，具體為氨基酸序列如seq?id?no.1所示的蛋白質(zhì)，或?yàn)榕cseqid?no.1所示氨基酸序列具有至少80%同源性序列，優(yōu)選具有至少90%同源性序列，更優(yōu)選具有至少95%同源性序列，且具有相應(yīng)功能的蛋白質(zhì)；

21、向?qū)Ш怂幔?’端具有磷酸化修飾；

22、目標(biāo)核酸，能夠被argonaute蛋白質(zhì)在向?qū)Ш怂峤閷?dǎo)下靶向裂解；

23、二價(jià)金屬陽(yáng)離子。

24、在本發(fā)明的核酸切割體系，argonaute蛋白質(zhì)與向?qū)Ш怂峤Y(jié)合形成eago復(fù)合物，該復(fù)合物與靶核酸接觸后，若靶核酸存在與向?qū)Ш怂嵝蛄谢パa(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，則argonaute蛋白質(zhì)在向?qū)Ш怂嶙R(shí)別引導(dǎo)下在特異性位點(diǎn)裂解靶核酸（即rna靶和/或dna靶）?；谠撉懈铙w系，argonaute蛋白質(zhì)能夠用于實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)和編輯。

25、優(yōu)選地，在上述核酸切割體系，二價(jià)金屬離子選自mg2+、mn2+、co2+、ca2+中的一種或多種；更為優(yōu)選地，二價(jià)金屬陽(yáng)離子為mn2+、mg2+，且二價(jià)金屬陽(yáng)離子濃度為0.5-60?mm。具體的，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：argonaute蛋白質(zhì)切割dna靶時(shí),在向?qū)na介導(dǎo)下，可以利用mn2+、co2+有效切割dna靶，其中在40mm?mn2+時(shí)最佳，在向?qū)na介導(dǎo)下，可以利用mn2+、mg2+有效切割dna靶，其中在0.5mm?mn2+時(shí)最佳；argonaute蛋白質(zhì)切割rna靶時(shí)，在向?qū)na介導(dǎo)下，可以利用mn2+、mg2+有效切割rna靶，其中在60mm?mg2+時(shí)最佳，在向?qū)na介導(dǎo)下，可以利用mg2+、mn2+、ca2+有效切割dna靶，其中在60mm?mg2+時(shí)最佳。

26、優(yōu)選地，在上述核酸切割體系，核酸切割體系的ph為3-10.5。

27、基于本發(fā)明所用的argonaute蛋白質(zhì)，本發(fā)明第三方面通過(guò)對(duì)seq?id?no.1所示序列的核酸酶活性位點(diǎn)進(jìn)行突變，提供了一種沉默突變體，該突變體完全喪失了切割活性。其中，活性位點(diǎn)為seq?id?no.1所示序列的第833位、第874位、第906位和第1045位；相對(duì)于野生型，突變體將第一位和第三位上的天冬氨酸（d）突變?yōu)楸彼幔╝）。

28、本發(fā)明提供的突變體可以融合其它效應(yīng)蛋白或結(jié)合被標(biāo)記的向?qū)Ш怂?，進(jìn)而拓展本發(fā)明argonaute蛋白質(zhì)的應(yīng)用方向。例如，將熒光標(biāo)記的向?qū)na裝載到突變體中，突變體引導(dǎo)dna與其互補(bǔ)的靶標(biāo)結(jié)合，由于dna具有熒光標(biāo)記，整個(gè)過(guò)程可以實(shí)現(xiàn)可視化；此外，熒光標(biāo)記的向?qū)na與rna靶結(jié)合的能力也可用于實(shí)現(xiàn)mirna的特異性可視化。

29、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

30、本發(fā)明提供了能在核酸鏈引導(dǎo)下切割靶標(biāo)核苷酸序列（即靶核酸）的一種argonaute蛋白質(zhì)以及其與向?qū)Ш怂嵝纬傻膹?fù)合物，該argonaute蛋白質(zhì)來(lái)自于植物水稻，有別于其他真核來(lái)源的argonaute，該argonaute蛋白質(zhì)不僅具有切割rna靶的活性也具有切割dna靶的活性，表明了其在核酸編輯和檢測(cè)上具有應(yīng)用潛力。

31、本發(fā)明提供的argonaute蛋白質(zhì)對(duì)磷酸化的向?qū)Ш怂幔磫捂渄na（ssdna）或rna）具有結(jié)合活性，并且對(duì)rna靶或dna靶具有核酸酶活性，故當(dāng)argonaute蛋白質(zhì)與向?qū)Ш怂岷蚭ago結(jié)合形成eago復(fù)合物后，其與靶核酸發(fā)生位點(diǎn)特異性切割反應(yīng)，并且可通過(guò)選擇具有特定核苷酸序列的向?qū)Ш怂醽?lái)調(diào)節(jié)位點(diǎn)特異性。

32、本發(fā)明中的eago復(fù)合物能有效的使用13-15?nt的向?qū)na和/或18-19?nt的向?qū)na特異切割dna靶或rna靶，特別是以ssdna作為向?qū)懈顁na靶時(shí)具有很高的活性，而向?qū)na相較于向?qū)na價(jià)格便宜，合成時(shí)間短，可節(jié)約成本。

33、本發(fā)明所用argonaute蛋白質(zhì)不存在crispr相關(guān)蛋白需依賴靶點(diǎn)附近的特殊核苷酸序列來(lái)識(shí)別和結(jié)合靶以及非特異性附帶切割的活性，且向?qū)Ш怂嵩O(shè)計(jì)更為方便，無(wú)需考慮位點(diǎn)限制。