本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種識別胰島素原的單克隆抗體及其應用。

背景技術：

1、胰島素原(proinsulin)是胰島素(insulin)生物合成過程中的一個重要前體，具有獨特的生物學特性和臨床意義。胰島素的生物合成起始于細胞漿中的胰島素前體－前胰島素原(preproinsulin)，新合成的前胰島素原包含110個氨基酸，在其氨基端信號肽的引領下，經跨膜轉位進入內質網，隨后被信號肽酶剪切形成另一個胰島素的前體－由86個氨基酸組成的胰島素原。在內質網中，胰島素原迅速進行氧化折疊，形成進化高度保守的三對二硫鍵和其正常的空間構象，正常折疊的胰島素原，被進一步從內質網轉運至高爾基體，進行進一步的加工剪切，形成胰島素和c肽存儲在分泌顆粒中。

2、胰島素原由胰島素和c肽兩部分組成，具有雙重免疫活性。這意味著胰島素原既可以與胰島素抗體結合，又能夠與c肽抗體結合。雖然胰島素原與胰島素在分子結構上有所相似，但其降糖活性僅為胰島素的5％-10％。生理情況下，只有極少量的胰島素原會被釋放到血液中。而在病理狀態(tài)下，如糖尿病、胰腺腫瘤、多囊卵巢綜合征或慢性腎功能不全等情況，機體產生胰島素抵抗或者合成大量胰島素，血液中胰島素原的水平會升高。本發(fā)明研發(fā)團隊的前期研究還發(fā)現(xiàn)，胰島素原分泌延遲可以作為評價胰島功能障礙更早期和敏感的臨床指標。

3、現(xiàn)階段胰島素原檢測試劑可用于糖尿病、胰島素瘤及胰島素抵抗綜合癥等疾病的診斷，以及準確判斷胰島β細胞的生理功能。但診斷胰島素原異常表達的手段還不夠完善，開發(fā)一種新型能夠識別胰島素原特定表位的單克隆抗體及檢測試劑非常有必要。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術中的不足，本發(fā)明公開一種識別胰島素原的單克隆抗體及其應用，所述單克隆抗體具有親和力好、效價較高等優(yōu)點，對于識別生物樣本中的胰島素原具有較強的特異性。

2、為了實現(xiàn)以上技術目的，第一方面，本發(fā)明提出一種識別胰島素原的單克隆抗體，所述單克隆抗體的輕鏈cdr3的氨基酸序列如seq?id?no:7、seq?id?no:13或seq?id?no:19所示；所述單克隆抗體的重鏈cdr3的氨基酸序列如seq?id?no:10、seq?id?no:16或seqidno:22所示。

3、在本發(fā)明的進一步示例中，所述單克隆抗體的輕鏈cdr1的氨基酸序列如seq?idno:8、seq?id?no:14或seq?id?no:20所示；和/或，所述單克隆抗體的輕鏈cdr2的氨基酸序列如seq?id?no:9、seq?id?no:15或seq?id?no:21所示。

4、在本發(fā)明的進一步示例中，所述單克隆抗體的重鏈cdr1的氨基酸序列如seq?idno:11、seq?id?no:17或seq?id?no:23所示；和/或，所述單克隆抗體的重鏈cdr2的氨基酸序列如seq?id?no:12、seq?id?no:18或seq?id?no:24所示。

5、需注意，本發(fā)明所述單克隆抗體高變區(qū)引入的部分突變并不會影響抗體分子與抗原的結合。在本發(fā)明的進一步示例中，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqid?no:1、seq?id?no:3或seq?id?no:5所示；或將seq?id?no:1、seq?id?no:3或seq?id?no:5經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與seq?id?no:1、seq?id?no:3或seqid?no:5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或與seq?id?no:1、seq?id?no:3或seq?idno:5具有至少90％的同源性(比如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等但不限于所例舉的數(shù)值)且與seq?id?no:1、seq?id?no:3或seq?id?no:5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

6、進一步地，所述所述單克隆抗體的輕鏈氨基酸序列包括輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)seqid?no:35。

7、在本發(fā)明的進一步示例中，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?idno:2、seq?id?no:4或seq?id?no:6所示；或將seq?id?no:2、seq?id?no:4或seq?id?no:6經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與seq?id?no:2、seq?id?no:4或seq?idno:6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或與seq?id?no:2、seq?id?no:4或seq?idno:6具有至少90％的同源性(比如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等但不限于所例舉的數(shù)值)且與seq?id?no:2、seq?id?no:4或seq?id?no:6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

8、進一步地，所述所述單克隆抗體的重鏈氨基酸序列包括重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)seqid?no:36。

9、在本發(fā)明的進一步示例中，所述單克隆抗體為全抗體或全抗體的抗原結合部分；進一步地，所述全抗體為igg1型；進一步地，所述抗原結合部分為fab片段、f(ab')2片段、單鏈抗體或全長抗體。在本發(fā)明進一步優(yōu)選示例中，所述單克隆抗體為全長抗體。

10、在本發(fā)明的進一步示例中，所述單克隆抗體所識別胰島素原的氨基酸序列如seqid?no:25、seq?id?no:26或seq?id?no:27所示。

11、本發(fā)明的再進一步示例中，提供了3個所述單克隆抗體，分別為單克隆抗體1、單克隆抗體2和單克隆抗體3，其中，單克隆抗體1的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別為seq?id?no:1、seq?id?no:2，單克隆抗體2的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別為seq?id?no:3、seq?id?no:4，單克隆抗體3的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別為seq?id?no:5、seq?id?no:6。

12、第二個方面，本發(fā)明提供了一種核酸分子，所述核酸分子編碼權利上述的識別胰島素原的單克隆抗體。

13、進一步地，編碼單克隆抗體1的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:28所示、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:29所示；編碼單克隆抗體2的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:30所示、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:31所示；編碼單克隆抗體3的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:32所示、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:33所示。

14、第三方面，本發(fā)明提出了上述識別胰島素原的單克隆抗體在檢測生物樣本中胰島素原中的用途。

15、本發(fā)明對所述生物樣本的具體種類不是限制的，比如人源組織、細胞、上清、血清、血漿等，本領域技術人員可根據需要采用本發(fā)明識別胰島素原的單克隆抗體用于檢測包含抗原的生物樣品，并不由此限定本發(fā)明的保護范圍。

16、第四個方面，本發(fā)明提出了上述識別胰島素原的單克隆抗體在制備胰島素體外免疫檢測試劑、試劑盒或藥物組合物中的應用；可通過特定將上述識別胰島素原的單克隆抗體應用于特定試劑盒中，從而可實現(xiàn)的對生物樣本中胰島素原含量的測定。

17、進一步地，所述試劑盒還包括酶標板、包被緩沖液、底物、底物顯色液或反應終止液中的任意一種或至少兩種的組合。

18、進一步地，所述藥物組合物還包括藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。

19、此外，本發(fā)明對于生產上述單克隆抗體的雜交瘤母細胞的制備方法不是限制的，本領域內技術人員可根據選擇。進一步的，生產上述單克隆抗體的雜交瘤母細胞的制備方法可選包括以下步驟：

20、(1)多肽合成：使用化學合成的方法合成氨基酸序列如seq?id?no:25、seq?id?no:26或seq?id?no:27所示的多肽，hplc純化。

21、(2)抗原制備：使用專利ief(免疫原性增強因子，immunogenicity?enhancementfactors)，將vlp(病毒類似顆粒，virus-like?particles)與傳統(tǒng)klh載體蛋白結合。

22、(3)免前檢測：選取8-12周齡雌性balb/c小鼠5只，眼眶采血并分離血清，使用elisa的方法檢測血清效價，包被抗原為多肽與bsa偶聯(lián)物。

23、(4)小鼠免疫：使用多肽與klh偶聯(lián)物作為免疫原進行免疫，并在最后一次注射免疫后，小鼠取血開始血清效價檢測，檢測方法同免前檢測。只有抗血清效價大于10k的小鼠才能進入分選階段，否則加免一次。

24、(5)抗體發(fā)現(xiàn)：使用常規(guī)雜交瘤制備流程獲取雜交瘤細胞株，使用免前檢測方法檢測雜交瘤細胞株上清，使用上清純化抗體進行復檢。選出一株elisa效價最高的細胞株，即可得到所述的雜交瘤母細胞。

25、此外，本發(fā)明對于生產上述單克隆抗體的方法不是限制的，本領域內技術人員可根據選擇。進一步地，所述單克隆抗體的制備方法可選為：(1)雜交瘤生產：使用無血清培養(yǎng)基標準生產流程進行細胞生產，使用protein?a/g親和柱層析方法分離純化抗體；(2)腹水生產：使用腹水標準生產流程生產抗體，使用protein?a/g親和柱層析方法分離純化抗體；(3)重組生產：通過分子生物學操作獲取雜交瘤細胞株的輕重鏈核酸，瓊脂糖凝膠驗證，通過限制性核酸內切酶和t4連接酶構建至表達載體中，并使用原核表達系統(tǒng)擴增質粒。使用瞬時轉染和構建穩(wěn)轉細胞株的方法進行細胞生產，使用protein?a/g親和柱層析方法分離純化抗體。

26、本發(fā)明涉及的氨基酸序列包括：

27、(1)單克隆抗體1

28、seq?id?no:1(輕鏈可變區(qū))：

29、divltqsplslpvslgdqasiscrssqnivhsngktylewylqkpgqspklliyniynrf?sgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycfqgshvpytfgggtkleik

30、seq?id?no:7(輕鏈cdr3)：

31、fqgshvpyt

32、seq?id?no:8(輕鏈cdr1)：

33、rssqnivhsngktyle

34、seq?id?no:9(輕鏈cdr2)：

35、niynrfs

36、seq?id?no:2(重鏈可變區(qū))：

37、qvqlqqsgaevvkpgasvkmsckasgysftsynmhwikqtpgqglewiggiypgng?essynqkfkgkatmtadkssntaymqfssltsedsavyycargdgfdywgqgttltvss

38、seq?id?no:10(重鏈cdr3)：

39、gdgfdy

40、seq?id?no:11(重鏈cdr1)：

41、synmh

42、seq?id?no:12(重鏈cdr2)：

43、giypgngessynqkfkg

44、(2)單克隆抗體2

45、seq?id?no:3(輕鏈可變區(qū))：

46、divltqspaslavslgqratisckasqsvdyngdsymnwyqqkpgqpptlliyvaskle?sgiparfsgsgsgtdftlnihpveeedvatyycqqtneepltfgagtklelk

47、seq?id?no:13(輕鏈cdr3)：

48、qqtneeplt

49、seq?id?no:14(輕鏈cdr1)：

50、kasqsvdyngdsymn

51、seq?id?no:15(輕鏈cdr2)：

52、vaskles

53、seq?id?no:4(重鏈可變區(qū))：

54、qvqleqsgpelvkpgasvrisckasgytftsyyvhwvrqrpgqglewigwihpgnins?kynekfkdkatltadkssttaymqlssltsedsavyfcsrsvdywgqgttltvss

55、seq?id?no:16(重鏈cdr3)：

56、svdy

57、seq?id?no:17(重鏈cdr1)：

58、syyvh

59、seq?id?no:18(重鏈cdr2)：

60、wihpgninskynekfkd

61、(3)單克隆抗體3

62、seq?id?no:5(輕鏈可變區(qū))：

63、divltqstalmaaspgekvtitcsvsssisssylhwyqqksetspkpwiygtsnlasgvp?vrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwsnypltfgagtklelk

64、seq?id?no:19(輕鏈cdr3)：

65、qqwsnyplt

66、seq?id?no:20(輕鏈cdr1)：

67、svsssisssylh

68、seq?id?no:21(輕鏈cdr2)：

69、gtsnlas

70、seq?id?no:6(重鏈可變區(qū))：

71、qvqleqsggglvqpkgslklscaasgfnfntngmnwvrqapgkglewvarirsksnnyatyyadsvkdrftisrddsqsmlylqmnnlktedtamyycvrdggygawfaywgqgslvtvsa

72、seq?id?no:22(重鏈cdr3)：

73、dggygawfay

74、seq?id?no:23(重鏈cdr1)：

75、tngmn

76、seq?id?no:24(重鏈cdr2)：

77、rirsksnnyatyyadsvkd

78、此外，輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為seq?id?no:34(輕鏈恒定區(qū))：

79、radaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtd?qdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec

80、重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為seq?id?no:35(重鏈恒定區(qū))：

81、asttppsvyplapgsansmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivvprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimntngsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk

82、另外，本發(fā)明中seq?id?no:25、seq?id?no:26或seq?id?no:27的氨基酸序列分別為：

83、seq?id?no:25：

84、plalegslqkrgiv

85、seq?id?no:26：

86、pktrreaedlqvgq

87、seq?id?no:27：

88、ksrrevedpqveqlec

89、本發(fā)明涉及的核酸分子序列包括：

90、編碼單克隆抗體1的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:28所示、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:29所示；

91、seq?id?no:28：

92、gacattgtgctcacccaatctccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagaacattgtacatagtaatggaaagacctatttagagtggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaatatttacaaccggttttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgttttcaaggttcacatgttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa

93、seq?id?no:29：

94、caggtccagctgcagcagtcaggggctgaggtggtgaagcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctactcatttaccagttacaatatgcactggataaagcagacacctggacagggcctggaatggattggaggtatttatccaggaaatggtgaaagttcctacaatcagaagttcaaaggcaaggccacaatgactgcagacaaatcctccaacacagcctacatgcagttcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattattgtgcaagaggggacggttttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca

95、編碼單克隆抗體2的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:30所示、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:31所示：

96、seq?id?no:30：

97、gacattgtgctcacccagtctccagcctctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatctcctgcaaggccagccaaagtgttgattataatggtgatagttatatgaactggtaccaacagaaaccgggacagccacccacactcctcatctatgttgcatccaagctagaatctgggatcccagccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgttgcaacctattactgtcagcaaactaatgaggaaccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa

98、seq?id?no:31：

99、caagttcagctggagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaggatatcctgcaaggcttctggctacaccttcacaagctactatgttcactgggtgaggcagaggcctggacagggacttgagtggattggatggattcatcctggaaatattaattctaaatacaatgagaaattcaaggacaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatgcagctcagcagcctgacctctgaggactctgcggtctatttctgttcaagatcggttgactactggggccaagggaccactctcacagtctcctca

100、編碼單克隆抗體3的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:32所示、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:33所示：

101、seq?id?no:32：

102、gatattgtgctgacccagtctacagcactcatggctgcatctccaggggagaaggtcaccatcacctgcagtgtcagctcaagtataagttccagctacttgcactggtaccagcagaagtcagaaacctcccccaaaccctggatttatggcacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatctgggacctcttattctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgtcaacagtggagtaattacccactcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa

103、seq?id?no:33：

104、caagttcagctggagcagtctggtggaggattggtgcagcctaaagggtcattgaaactctcatgtgcagcctctggatttaacttcaataccaatggcatgaactgggtccgccaggccccaggaaagggtttggagtgggttgctcgcataagaagtaaaagtaataattatgcaacatattatgccgattcagtgaaagacaggttcaccatctccagagatgattcacaaagcatgctctatctgcaaatgaacaacttgaaaactgaggacacagccatgtattactgtgtgagagacgggggttacggggcctggtttgcttactggggccaagggtctctggtcactgtctctgca

105、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明識別胰島素原的單克隆抗體能特異性識別人/小鼠胰島素原中的特定抗原表位，識別特異性強、親和力好、效價較高，具有廣泛的應用價值。