本發(fā)明屬于基因生物，具體涉及鑒定小麥抗莖基腐病基因的snp位點(diǎn)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、小麥莖基腐?。╢usarium?crown?rot，fcr）是由多種鐮孢菌（ fusarium?spp.）引起的一種典型土傳病害，廣泛分布于全球各地，并呈不斷蔓延和加重趨勢(shì)。在我國(guó)，小麥莖基腐病主要由假禾谷鐮刀菌（ fusarium?pseudograminearum）引起。小麥幼苗被鐮刀菌侵染后，莖基部葉鞘和莖稈變褐，嚴(yán)重時(shí)引起幼苗發(fā)黃、枯萎；灌漿期發(fā)病可導(dǎo)致穗部干枯。莖基腐病的發(fā)生不但給小麥造成嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失，在病害發(fā)展過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生don等生物毒素和次級(jí)代謝物，對(duì)食品和飼料產(chǎn)品也具有嚴(yán)重的負(fù)面影響。

2、莖基腐病是近年來(lái)包括我國(guó)在內(nèi)世界上主要小麥生產(chǎn)國(guó)最重要的病害之一。由于近年來(lái)天氣變化，干旱頻發(fā)，莖基腐病發(fā)生態(tài)勢(shì)嚴(yán)峻，侵染范圍廣，危害程度大，已經(jīng)引起全世界小麥研究者的重點(diǎn)關(guān)注。然而，目前針對(duì)小麥莖基腐病的研究主要集中在病原菌的收集、不同小麥品種的抗性鑒定以及抗病基因的初步定位。小麥莖基腐病抗病基因的發(fā)掘和利用及抗病基因參與的調(diào)控途徑等研究還處在起步階段。

3、近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從抗病基因發(fā)掘和種質(zhì)資源鑒定等方面開(kāi)展了一系列研究。但是，已發(fā)掘的主效抗病基因少且分子標(biāo)記缺乏、可用于育種的抗源匱乏仍是當(dāng)前抗病育種工作面臨的主要問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何快速準(zhǔn)確地鑒定小麥抗莖基腐病基因。

2、為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了檢測(cè)小麥基因組中snp位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)的應(yīng)用，所述snp位點(diǎn)為小麥基因組中的一個(gè)位點(diǎn)，其核苷酸種類為a或g，為序列表中序列1的第51位核苷酸；所述應(yīng)用為下述任一種：

3、a1）所述物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定小麥抗莖基腐病抗性的應(yīng)用，

4、a2）所述物質(zhì)在小麥育種中的應(yīng)用，

5、a3）所述物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定小麥抗莖基腐病抗性的產(chǎn)品中的應(yīng)用，

6、a4）所述物質(zhì)在制備小麥育種的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

7、上述物質(zhì)為如下b1）、b2）或b3）：

8、b1）所述物質(zhì)為擴(kuò)增包括所述snp位點(diǎn)在內(nèi)的小麥基因組dna片段的引物組合物，

9、b2）所述物質(zhì)為含有b1）所述引物組合物的pcr試劑，

10、b3）所述物質(zhì)為含有b1）所述引物組合物或b2）所述pcr試劑的試劑盒。

11、上述應(yīng)用中，所述引物組合物可被標(biāo)記物標(biāo)記也可不被標(biāo)記物標(biāo)記。所述標(biāo)記物指可用于提供可檢測(cè)的效果且可以連接至核酸的任何原子或分子。標(biāo)記物包括但不限于染料；放射性標(biāo)記，諸如32p；結(jié)合部分，諸如生物素（biotin）；半抗原，諸如地高辛（dig）；發(fā)光、發(fā)磷光或發(fā)熒光部分；和單獨(dú)的熒光染料或與可以通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fret）抑制或移動(dòng)發(fā)射光譜的部分組合的熒光染料。標(biāo)記可以提供可通過(guò)熒光、放射性、比色、重量測(cè)定、x射線衍射或吸收、磁性、酶活性等檢測(cè)的信號(hào)。標(biāo)記可以是帶電荷的部分（正電荷或負(fù)電荷）或可選地，可以是電荷中性的。標(biāo)記可以包括核酸序列或蛋白序列或由其組合，只要包含標(biāo)記的序列是可檢測(cè)的。在一些實(shí)施方案中，核酸在沒(méi)有標(biāo)記的情況下直接檢測(cè)（例如，直接讀取序列）。

12、上述引物組合物可由引物a、引物b和/或引物c組成；

13、所述引物a為核苷酸序列是序列表中序列2的單鏈dna分子或核苷酸序列是序列表中序列1的第22-41位的單鏈dna，

14、所述引物b為核苷酸序列是序列表中序列3的單鏈dna分子或核苷酸序列是序列表中序列2的第22-41位的單鏈dna，

15、所述引物c是核苷酸序列是序列表中序列4的單鏈dna分子。

16、本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定小麥抗莖基腐病性狀的方法，所述方法包括檢測(cè)待測(cè)小麥基因組中snp位點(diǎn)的基因型，根據(jù)所述基因型鑒定或輔助鑒定小麥抗莖基腐病性狀，所述snp位點(diǎn)為上述snp位點(diǎn)。

17、上述方法中，所述snp位點(diǎn)的基因型為aa、ag或gg，所述aa是所述snp位點(diǎn)為a的純合型，所述gg是所述snp位點(diǎn)為g的純合型，所述ag是所述snp位點(diǎn)為a和g的雜合型。

18、上述方法中，所述小麥可為自交系或純系。

19、上述方法中，根據(jù)所述基因型鑒定或輔助鑒定小麥籽粒性狀可為所述基因型為aa的待測(cè)小麥抗莖基腐病性狀高于所述基因型為gg的待測(cè)小麥。

20、上述方法在小麥育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

21、本發(fā)明還提供了一種小麥育種的方法，所述方法包括檢測(cè)小麥基因組中上述snp位點(diǎn)的基因型，選擇所述snp位點(diǎn)的基因型為aa的小麥作為親本進(jìn)行小麥抗莖基腐病育種；該位點(diǎn)也可用于小麥莖基腐病抗性水平篩選，所述aa是所述snp位點(diǎn)為a的純合型。所述育種的育種目標(biāo)包括小麥抗莖基腐病。所述育種的目的包括培育小麥抗莖基腐病性狀優(yōu)秀（抗莖基腐病性狀高于親本）的小麥。

22、作為一種實(shí)施方法，小麥育種的方法可包括如下步驟：

23、（1）以待測(cè)小麥的基因組dna為模板，采用上述引物組進(jìn)行kasp；

24、（2）完成步驟（1）后，進(jìn)行熒光檢測(cè)，確定待測(cè)小麥所述snp位點(diǎn)的基因型；

25、（3）選擇aa基因型小麥進(jìn)行育種。

26、本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)小麥基因組中snp位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型的產(chǎn)品，所述snp位點(diǎn)為上述snp位點(diǎn)，所述產(chǎn)品含有上述物質(zhì)，所述產(chǎn)品為下述任一種：

27、c1）檢測(cè)或輔助檢測(cè)小麥抗莖基腐病性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或基因型的產(chǎn)品，

28、c2）鑒定或輔助鑒定小麥抗莖基腐病性狀的產(chǎn)品，

29、c3）用于小麥育種的產(chǎn)品，

30、c4）篩選或選育抗莖基腐病的小麥單株或株系或品系或品種的產(chǎn)品。

31、可選地，所述產(chǎn)品可為如下任一種：

32、d1）所述產(chǎn)品為擴(kuò)增包括所述snp位點(diǎn)在內(nèi)的小麥基因組dna片段的引物組合物，

33、d2）所述產(chǎn)品為含有d1）所述引物組合物的pcr試劑，

34、d3）所述產(chǎn)品為含有d1）所述引物組合物或d2）所述pcr試劑的試劑盒。

35、上述引物組合物可由引物a、引物b和/或引物c組成；

36、所述引物a為核苷酸序列是序列表中序列2的單鏈dna分子或核苷酸序列是序列表中序列2的第22-41位的單鏈dna，

37、所述引物b為核苷酸序列是序列表中序列3的單鏈dna分子或核苷酸序列是序列表中序列3的第22-41位的單鏈dna，

38、所述引物c是核苷酸序列是序列表中序列4的單鏈dna分子。

39、本發(fā)明還提供了dna分子，所述dna分子的核苷酸序列是序列表中的序列1。

40、所述序列1的具體序列為：5｀-gttagttgagtctgtaatagggcggctcctgctatcatgcgatcggcgga[ag]catgtcgtcgtaggtgcttggtatgttgaagctccggatttcatccgagc-3｀。

41、上述dna分子的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，所述應(yīng)用為如下任一種：

42、e1）所述dna分子在鑒定或輔助鑒定小麥抗莖基腐病性狀的應(yīng)用，

43、e2）所述dna分子在小麥育種中的應(yīng)用，

44、e3）所述dna分子在制備鑒定或輔助鑒定小麥抗莖基腐病性狀的產(chǎn)品中的應(yīng)用，

45、e4）所述dna分子在制備小麥育種的產(chǎn)品中的應(yīng)用，

46、e5）所述dna分子在篩選或選育抗莖基腐病性狀優(yōu)秀的小麥單株或株系或品系或品種的產(chǎn)品中的應(yīng)用，

47、e6）所述dna分子在輔助篩選或輔助選育抗莖基腐病性狀優(yōu)秀的小麥單株或株系或品系或品種的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

48、所述產(chǎn)品可為試劑盒。

49、所述試劑盒包含擴(kuò)增包括所述snp位點(diǎn)在內(nèi)的小麥基因組dna片段的引物組合物。

50、用上述引物組合物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)可按照如下體系進(jìn)行：擴(kuò)增反應(yīng)總體積4?μl，0.048?μl?primer?mix，2.0?μl?master?mix，1.952μl?template?dna（50?ng/μl），mastermix購(gòu)買自lgc公司，primer?mix的配比為：12%hex引物、12%fam引物、30%的common引物，引物由上海生工公司合成。擴(kuò)增使用384孔pcr儀（bio-rad,?s1000tmthermal?cycler），程序如下：94℃?15?min；94℃?20s、6355℃?1?min（每個(gè)循環(huán)降1℃），10個(gè)循環(huán)；94℃?20s、55℃60s，32個(gè)循環(huán)。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物放在自動(dòng)聚焦熒光多功能酶標(biāo)儀（pherastarplus?snp,?bmglabtech）中讀取最終熒光數(shù)據(jù)，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入klustercaller?v3.4軟件（lgc,hoddesdon,?uk）進(jìn)行基因分型。

51、上述檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物方法為對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物放在自動(dòng)聚焦熒光多功能酶標(biāo)儀（pherastarplus?snp,?bmg?labtech）中讀取最終熒光數(shù)據(jù)，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入klustercaller?v3.4軟件（lgc,?hoddesdon,?uk）進(jìn)行基因分型。

52、本發(fā)明可用于快速準(zhǔn)確鑒定或輔助鑒定小麥抗莖基腐病性狀，可以對(duì)小麥材料進(jìn)行早期篩選，可用于小麥分子標(biāo)記輔助育種。將本發(fā)明中的物質(zhì)運(yùn)用于小麥抗莖基腐病性狀分子標(biāo)記輔助選擇，能快速篩選出小麥抗莖基腐病性狀優(yōu)秀的小麥品種（種質(zhì)），從而加速培育小麥抗病新品種的進(jìn)程，在發(fā)掘小麥種質(zhì)資源和選育具有較高抗莖基腐病性狀的小麥品種的研究中具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。