本發(fā)明涉及病原體分子檢測，特別涉及解脲脲原體和微小脲原體靶基因的應(yīng)用、引物探針組合及試劑盒。

背景技術(shù)：

1、淋球奈瑟菌是經(jīng)典的性傳播疾病淋病的病原菌，該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，淋球菌潛伏期短，能夠引起急慢性的生殖道炎癥反應(yīng)，嚴重情況能夠?qū)е虏辉胁挥?，異位妊娠，胎兒發(fā)育不良等后果。但在成年人中5～20％的男性，50％女性無癥狀，多在出現(xiàn)并發(fā)癥時才被發(fā)現(xiàn)錯失最佳的治愈時期，因此淋病已為了國內(nèi)外的重大衛(wèi)生問題。

2、人脲原體是一種原核細胞微生物，歸屬于支原體科中的脲原體屬，無細胞壁，也是目前發(fā)現(xiàn)的最小的能夠在無生命體培養(yǎng)基中繁殖的微生物。其主要存在于泌尿生殖道及呼吸道中，是一種條件致病微生物，可以在機體免疫抑制時侵犯宿主粘膜。傳播途徑主要是性傳播，也可以通過母嬰垂直傳播，或在胎兒出生時通過體液傳播。目前已知人脲原體主要分為兩個生物群(微小脲原體和解脲脲原體)，14種血清型。微小脲原體包括血清型1，3，6和14，而其余10種血清型屬于解脲脲原體。人脲原體致病性的不同可能與不同生物群、血清型及宿主因素有關(guān),但目前機制尚未明確，大量證據(jù)表明微小脲原體易于被攜帶，分型有助于其致病機理研究。

3、傳統(tǒng)的淋球奈瑟菌、人脲原體檢測方法包括培養(yǎng)檢測，抗原檢測和核酸擴增檢測。核酸擴增檢測檢測具有簡捷、快速、可靠的特點，但現(xiàn)有的核酸擴增檢測試劑盒大多存在特異性差的缺陷，靶標組合方式少，對樣品要求嚴格，需要設(shè)計多組引物并且操作繁雜，檢測試劑需冷凍保存。因此，本領(lǐng)域需求一種產(chǎn)品能夠簡單、快速、準確地區(qū)分上述病原體。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了解脲脲原體和微小脲原體靶基因的應(yīng)用、引物探針組合及試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，主要利用多重熒光pcr分析方法，通過檢測不同病原體上的靶點，對不同病原體進行檢測，從而在單管反應(yīng)體系中同時實現(xiàn)淋球菌、微小脲原體和解脲脲原體的檢測和區(qū)分。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了靶基因在制備鑒別解脲脲原體和微小脲原體的產(chǎn)品中的應(yīng)用：

4、所述靶基因分別具有：

5、(i)、如seq?id?no.11所示的鑒別解脲脲原體的核苷酸序列，如seq?id?no.12所示的鑒別微小脲原體的核苷酸序列；和/或

6、(ii)、與(i)所示的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性而與(i)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

7、(iii)、與(i)或(ii)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與(i)或(ii)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

8、(iv)、與(i)、(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

9、本發(fā)明還提供了引物探針組合，所述引物探針組合包括：

10、(i)、具有如seq?id?no.1所示核苷酸序列的檢測淋球菌的上游引物；和

11、具有如seq?id?no.2所示核苷酸序列的檢測淋球菌的下游引物；和

12、具有如seq?id?no.3所示核苷酸序列的檢測淋球菌的探針；和/或

13、(ii)、具有如seq?id?no.4所示核苷酸序列的檢測微小脲原體的上游引物；和

14、具有如seq?id?no.5所示核苷酸序列的檢測微小脲原體的下游引物；和

15、具有如seq?id?no.6所示核苷酸序列的檢測微小脲原體的探針；和/或

16、(iii)、具有如seq?id?no.4所示核苷酸序列的檢測解脲脲原體的上游引物；和

17、具有如seq?id?no.5所示核苷酸序列的檢測解脲脲原體的下游引物；和

18、具有如seq?id?no.7所示核苷酸序列的檢測解脲脲原體的探針；或

19、(iv)、與(i)至(iii)任一項所示的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性而與(i)至(iii)任一項所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

20、(v)、與(i)至(iv)任一項所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與(i)至(iv)任一項所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

21、(vi)、與(i)至(v)任一項述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

22、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，檢測所述解脲脲原體的引物對擴增的片段如seq?id?no.11所示；檢測所述微小脲原體的引物對擴增的片段如seq?id?no.12所示。

23、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述引物探針組合還包括擴增檢測內(nèi)標基因的引物對和探針；

24、所述內(nèi)標基因包括β-珠蛋白、rna酶p基因、actin或gapdh中的一種或多種。

25、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述引物探針組合還包括：

26、(i)、具有如seq?id?no.8所示核苷酸序列的檢測內(nèi)標基因的上游引物；和

27、具有如seq?id?no.9所示核苷酸序列的檢測內(nèi)標基因的下游引物；和

28、具有如seq?id?no.10所示核苷酸序列的檢測內(nèi)標的探針；或

29、(ii)、與(i)所示的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性而與(i)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

30、(iii)、與(i)或(ii)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與(i)或(ii)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

31、(iv)、與(i)、(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

32、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述探針包括熒光基團；所述熒光基團包括fam、hex、rox、vic、cy5或cy5.5中的一個或多個。

33、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，如seq?id?no.3所示探針連接fam熒光基團；如seq?id?no.6所示探針連接rox熒光基團；如seq?id?no.7所示探針連接cy5熒光基團；如seqid?no.10所示探針連接hex熒光基團。

34、本發(fā)明還提供了所述引物探針組合在制備檢測和/或鑒定淋球菌、微小脲原體和解脲脲原體的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

35、本發(fā)明還提供了所述引物探針組合在制備檢測生殖道炎癥的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

36、本發(fā)明還提供了組合試劑，包括所述引物探針組合。

37、本發(fā)明還提供了試劑盒，包括如下任意項及pcr反應(yīng)試劑：

38、(i)、所述引物探針組合；和/或

39、(ii)、所述組合試劑。

40、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述pcr反應(yīng)試劑包括如下任意一種或幾種：dntps、dna聚合酶、udg酶、pcr增強劑、鎂離子。

41、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述pcr增強劑包括dmso。

42、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述鎂離子包括mgcl2。

43、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述試劑盒的反應(yīng)體系包括：

44、

45、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述試劑盒還包括陰性質(zhì)控品和陽性指控品；所述陰性質(zhì)控品包括內(nèi)標質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)控品包括淋球菌、微小脲原體、解脲脲原體和內(nèi)標質(zhì)粒。

46、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述pcr的反應(yīng)程序包括：

47、

48、

49、本發(fā)明包括但不限于提供了如下有益效果：

50、本發(fā)明提供了解脲脲原體和微小脲原體靶基因的應(yīng)用、引物探針組合及試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，主要利用多重熒光pcr分析方法，通過檢測不同病原體上的靶點，對不同病原體進行檢測，從而在單管反應(yīng)體系中同時實現(xiàn)淋球菌、微小脲原體和解脲脲原體的檢測和區(qū)分。本發(fā)明的試劑盒，其檢測的靈敏度達到400copies/ml，特異性好，檢測更為準確，且能在2～8℃保存至12個月。