本發(fā)明涉及生命科學和生物，具體涉及一種用于檢測百日咳鮑特菌23srrna基因紅霉素耐藥位點a2047g變異的試劑盒。

背景技術：

1、百日咳(whooping?cough)是一種流行周期為2～5年的區(qū)域性急性呼吸道傳染病，通過咳嗽飛沫空氣傳播感染人類，是我國嚴格管理的乙類法定傳染病。百日咳鮑特菌(bordetellapertussis，bp)是引起百日咳最主要的病原菌，人群普遍易感，但主要引起兒童呼吸道疾病，年齡越小，病情越重，易發(fā)展為窒息、驚厥以及肺炎、百日咳腦病、心血管系統障礙、營養(yǎng)不良等嚴重威脅兒童生命健康的并發(fā)癥，6月齡以下嬰幼兒是高危人群。及時診斷和治療傳染源、接種疫苗保護易感染人群是阻斷疫情傳播最有效的辦法。

2、百日咳感染的潛伏期一般為7～10d，甚至達21d，病程可分為卡他期、發(fā)作期和恢復期，對于具有典型癥狀的患者，可直接作出臨床診斷，具有快速簡便等特點，但對于接種過疫苗、青少年及成人，多為非典型病例，仍需要完善實驗室相關檢查后才能確診。實驗室檢測主要包括病原學、血清學和其他方法學，是百日咳感染者診斷和鑒別診斷最重要的手段和保障，尤其對于臨床癥狀不典型的患者具有重要意義。

3、近年來，中國乃至全球百日咳發(fā)病率明顯上升，紅霉素為代表的大環(huán)內酯類抗生素是治療百日咳及預防性服藥的首選抗生素。因此百日咳鮑特菌bp對紅霉素的耐藥性也受到越來越多人們的關注，大量研究證實百日咳鮑特菌23sr?rna基因的a2047g突變與其對紅霉素的耐藥性有關，即野生型菌株(敏感株)為a2047位點，突變型菌株(耐藥株)為2047g位點?；蛐蛄袦y定技術可直接檢測耐藥位點是否突變，也是行業(yè)內公認的金標準，但該技術費用相對昂貴且耗時較長，不適用于普通微生物實驗室，尤其是經濟不發(fā)達地區(qū)。因此，有必要建立一種簡單、快速檢測百日咳鮑特菌23s?rrna耐藥位點變異的試劑盒檢測方法，能方便快速幫助實驗室判斷百日咳鮑紅霉素耐藥性，為該傳染病早診斷、早指導用藥、早治療爭取時間。

技術實現思路

1、鑒于核酸檢測是直接檢測病原體核酸，具有高敏感，高準確性和短檢測窗口期等優(yōu)點，可以對于傳染病早診斷、早指導用藥、早治療爭取時間，因此，本發(fā)明提供了一種利用實時熒光定量pcr檢測百日咳鮑特菌23s?rrna耐藥位點變異引物組合和試劑盒，可快速檢測百日咳鮑特菌是否紅霉素耐藥。

2、本發(fā)明采用的技術方案是：

3、實時熒光定量pcr檢測百日咳鮑特菌23s?rrna耐藥位點變異的引物組合，所述引物組合包括靶點擴增引物組、野生型熒光探針、突變型熒光探針，序列如下所示：

4、靶點擴增引物組：

5、bp-f:gttaagtgatggggtgcaagct

6、bp-r:tggcgactcgagttctgcgc；

7、野生型熒光探針bp-probe-w：ctagacggaaagacccca

8、突變型熒光探針bp-probe-t：tagacgggaagaccccat。

9、進一步，所述引物組合還包括內參擴增引物組和內參檢測熒光探針，序列如下所示：

10、內參擴增引物組

11、gapdh-f:ggctgctcacatattctg

12、gapdh-r:aagagacaagaggcaaga

13、內參檢測熒光探針gapdh-probe：agcctcccctcctcatgcc。

14、所述野生型熒光探針、突變型熒光探針、內參檢測熒光探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團；且野生型熒光探針、突變型熒光探針、內參檢測熒光探針的熒光報告基團各不相同。

15、進一步，所述熒光報告基團為fam、hex、cy5、tet、joe或tamra中的一種，所述熒光淬滅基團為bhq1、bhq2、bhq3或mgb中的一種。

16、優(yōu)選的，野生型熒光探針的5’端標記有熒光報告基團fam，3’端標記有熒光淬滅基團mgb，序列為bp-probe-w：

17、fam-ctagacggaaagacccca-mgb。

18、優(yōu)選的，突變型熒光探針的5’端標記有熒光報告基團hex，3’端標記有熒光淬滅基團mgb，序列為bp-probe-t：hex-tagacgggaagaccccat-mgb。

19、優(yōu)選的，內參檢測熒光探針的5’端標記有熒光報告基團cy5，3’端標記有熒光淬滅基團bhq2，序列為gapdh-probe：

20、cy5-agcctcccctcctcatgcc-bhq2。

21、本發(fā)明還提供一種實時熒光定量pcr檢測百日咳鮑特菌23s?rrna耐藥位點變異的試劑盒，所述試劑盒包括靶點擴增引物組、野生型熒光探針、突變型熒光探針、內參擴增引物組和內參檢測熒光探針。

22、所述實時熒光定量pcr檢測百日咳鮑特菌23s?rrna耐藥位點變異的試劑盒還可以包括實時熒光定量pcr擴增反應試劑，所述實時熒光定量pcr擴增反應試劑包括擴增酶，緩沖液等，可采用商品化的實時熒光定量pcr檢測試劑。

23、所述試劑盒還可以包括質控品，所述質控品包括百日咳鮑特菌耐藥陽性質控品、百日咳鮑特菌耐藥陰性質控品和百日咳鮑特菌陰性質控品。

24、所述百日咳鮑特菌耐藥陽性質控品為含有seq?no?1所示序列和seq?no3所示內參序列的dna質粒。

25、所述百日咳鮑特菌耐藥陰性質控品為含有seq?no?2所示序列和seq?no3所示內參序列的dna質粒。

26、所述百日咳鮑特菌陰性質控品為不含有百日咳鮑特菌dna，含有seq?no3所示內參序列的dna質粒。

27、seq?no?1，為含有23s?rrna耐藥位點a2047g變異的序列片段：

28、aaggttaagtgatggggtgcaagctcttgatcgaagccccggtaaacggcggccgtaactataacggtcctaaggtagcgaaattccttgtcgggtaagttccgacctgcacgaatggcgtaacgatggccacactgtctcctcctgagactcagcgaagttgaagtgtttgtgatgatgcaatctacccgcggctagacgggaagaccccatgaacctttactgtagctttgcattggactgtgaaccggcctgtgtaggataggtgggaggcgcagaactcgagtcgccagattcga

29、百日咳耐藥陰性質控品，質粒中包括以下seq?no?2所示序列：

30、seq?no?2：

31、aaggttaagtgatggggtgcaagctcttgatcgaagccccggtaaacggcggccgtaactataacggtcctaaggtagcgaaattccttgtcgggtaagttccgacctgcacgaatggcgtaacgatggccacactgtctcctcctgagactcagcgaagttgaagtgtttgtgatgatgcaatctacccgcggctagacggaaagaccccatgaacctttactgtagctttgcattggactgtgaaccggcctgtgtaggataggtgggaggcgcagaactcgagtcgccagattcga

32、seq?no?3，內參序列：

33、ggctgctcacatattctggaggagcctcccctcctcatgccttcttgcc?tcttgtctctt。

34、本發(fā)明還提供一種實時熒光定量pcr檢測百日咳鮑特菌23s?rrna耐藥位點變異的方法，所述方法采用所述實時熒光定量pcr檢測百日咳鮑特菌23s?rrna耐藥位點變異的試劑盒，對待測樣本進行實時熒光定量pcr檢測，獲得待測樣本的百日咳鮑特菌的耐藥情況，所述方法包括以下步驟：

35、(1)待測樣本提取核酸；

36、(2)以提取的核酸作為模板dna，配制熒光定量pcr檢測體系，所述熒光定量pcr檢測體系包括靶點擴增引物組、野生型熒光探針、突變型熒光探針、內參擴增引物組和內參檢測熒光探針，進行熒光定量pcr檢測，根據三種不同熒光通道的擴增曲線進行分析，判斷待測樣本是否含有百日咳鮑特菌以及百日咳鮑特菌的耐藥情況。

37、進一步，所述步驟(2)中，所述熒光定量pcr檢測體系包括靶點擴增引物組、野生型熒光探針、突變型熒光探針、內參擴增引物組和內參檢測熒光探針、qpcr?mix、50×rox和滅菌水。

38、靶點擴增引物組、野生型熒光探針、突變型熒光探針、內參擴增引物組和內參檢測熒光探針的濃度各自為1～10μm，優(yōu)選10μm。

39、優(yōu)選的，所述熒光定量pcr檢測體系為20μl體系，包括以下組分：10μl?qpcr?mix，0.32μl野生型熒光探針bp-probe-w，0.32μl突變型熒光探針bp-probe-t，0.32μl內參檢測熒光探針gapdh-probe，0.64μl靶點擴增引物bp-f，0.64μl靶點擴增引物bp-r，0.64μl內參擴增引物gapdh-f，0.64μl內參擴增引物gapdh-r，0.4μl?50×rox，1.8μl模板dna，4.28μlddh2o。

40、實時熒光定量pcr的反應程序為：95℃預變性1min；95℃變性10s，58℃退火和延伸35s，40個循環(huán)。

41、進一步，所述步驟(2)中，根據三種不同熒光通道的擴增曲線進行分析，具體步驟為：

42、a)質控品判定實驗結果有效性：

43、①百日咳鮑特菌耐藥陽性質控品的hex通道和cy5通道都產生擴增曲線，fam通道無擴增曲線，且ct值≤38；

44、②百日咳鮑特菌耐藥陰性質控品的fam通道和cy5通道都產生擴增曲線，且ct值≤38，hex通道無擴增曲線；

45、③百日咳鮑特菌陰性質控品cy5通道有擴增曲線，且ct值≤38，fam通道、hex通道均無擴增曲線；

46、滿足以上三點，判定實驗結果可靠有效；如果以上任一項不符合要求，實驗結果無效；

47、b)在滿足條件a)實驗結果有效的情況下，按以下進行判定：

48、1)待測樣品的fam通道和cy5通道都產生擴增曲線，且ct值≤38，hex通道無擴增曲線，則判定樣本是百日咳陽性和百日咳耐藥陰性；

49、2)待測樣品的hex通道和cy5通道都產生擴增曲線，且ct值≤38，fam通道無擴增曲線，則判定樣本是百日咳陽性和百日咳耐藥陽性；

50、3)待測樣品的fam通道、hex通道均無擴增曲線，cy5通道有擴增曲線且ct值≤38，則判定樣本為百日咳陰性；

51、4)待測樣品的cy5通道無曲線，則判定樣本不合格；

52、本發(fā)明在實時熒光定量pcr檢測方法中，通過不同熒光標記(fam、hex、cy5)分別標記三種探針，一例樣本在一管pcr反應體系中可同時檢測百日咳鮑特菌23s?rrna基因及人源內參gapdh基因，可以同時檢測出百日咳鮑特菌紅霉素耐藥位點a2047g未變異的a2047耐藥野生型菌株(敏感株)和變異的2047g耐藥突變型(耐藥株)。

53、本發(fā)明的有益效果在于：利用本發(fā)明的試劑盒，對已提取鼻咽拭子樣本的dna進行實時熒光定量pcr，可檢測樣本中百日咳鮑特菌核酸是否存在及23s?rrna耐藥位點是否變異，從而獲得百日咳鮑特菌以及紅霉素耐藥性的檢測結果，本發(fā)明的檢測結果具有高準確性，高敏感性和檢測窗口期短等優(yōu)點，可應用于臨床診斷、公共衛(wèi)生監(jiān)測及科學研究等領域，提高百日咳傳染病的檢測效率和耐藥檢測水平，有助于早診斷、早指導用藥、早治療，為百日咳感染的防控和治療提供科學依據，具有重要的應用價值和廣闊的市場前景。