本發(fā)明涉及一種不帶蛋白標簽的核酸酶制備方法及其應用，屬于蛋白質工程和生物制藥領域。

背景技術：

0、技術背景

1、核酸酶是來自粘質沙雷氏菌serratia?marcescens，經基因工程改進的核酸內切酶。核酸酶能降解所有形式(單鏈、雙鏈、線性、環(huán)狀)的dna和rna，在廣泛條件范圍具有很高的特異性。它能將所有的核酸完全消化成3-5堿基長度的單磷酸寡核苷酸。

2、核酸的用途十分廣泛，在生物制品制備的過程中，細胞或細菌裂解時核酸釋放會產生黏度，核酸酶能迅速水解核酸，可以有效中間產品的降低粘度，減少處理時間，增加蛋白產量。比如，在層析純化時，可以有效避免由于大量核酸吸附在層析介質上而降低蛋白質的有效載量從而降低純化得率。在elisa、免疫印跡分析等實驗中，可以提高分辨率和回收率。在生物制品中，消除重組蛋白、疫苗等生物制品的外源性核酸殘留。

3、目前，核酸酶制備技術雖然已經比較完善了，大型得生物公司也有了較為完善的生產體系，但需要用到大型高精密的儀器設備，且生產成本較高，售價昂貴。為了降低核酸酶的制備成本，對核酸酶的生產工藝進行優(yōu)化是十分具有經濟價值的。中國專利《一種制備高效核酸酶的方法及其應用》(cn?114854719?a)利用酵母真核系統(tǒng)制備高效核酸酶，雖然該系統(tǒng)可以實現(xiàn)外源蛋白的表達，但是在酵母體內表達的蛋白容易形成包涵體，且酵母本身合成的蛋白總量要比大腸桿菌的多，不利于后續(xù)的純化步驟；除此之外，酵母的生長速率也比大腸桿菌的慢，從而加大了時間成本。綜上所述，急需一個高效且生產成本低、最能還原蛋白結構進而降解效率最高的核酸酶制備方法。

技術實現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明提供了一種不帶蛋白標簽的核酸酶制備方法及其應用。所述核酸酶的制備方法的具體步驟如下：將編碼核酸酶的序列連接到表達載體上，所述表達載體上帶有his蛋白標簽、tev蛋白酶酶切位點和蛋白接頭(linker)序列等元件，且元件的排列順序為his標簽-tev酶酶切位點-linker序列-核酸酶-linker序列-tev酶酶切位點-his標簽-his標簽；將該重組載體轉入大腸桿菌de3菌株中，然后用iptg誘導外源蛋白表達；用tev酶切除經ni柱初步純化的融合蛋白上的his標簽，再次純化和濃縮蛋白，最終得到高純度且高酶活的無蛋白標簽核酸酶。該方法步驟簡單，不需要高級的儀器且所用試劑價格便宜，生產成本低；本發(fā)明提供的核酸酶制備方法利用了天然的信號肽(seq?id?no:2)，使折疊后的核酸酶能夠分泌到胞外，而在分泌的過程中，信號肽會被自動切割掉，從而不會影響核酸酶的結構；該方法最大限度還原了核酸酶的結構，不含蛋白標簽和信號肽，且核酸酶得率、純度和酶活不亞于其他公司，因此利用該制備流程生產核酸酶能增加產品的利潤與競爭力。

2、一方面，本發(fā)明提供了一種核酸酶序列，所述序列包括核酸酶、蛋白標簽、蛋白酶酶切位點和蛋白接頭序列的任意一種或多種。

3、目前，核酸酶制備方法的優(yōu)化都集中在編碼核酸酶序列的改良、信號肽的篩選、表達外源蛋白體系的優(yōu)化等，但都沒有提出能夠最大限度還原核酸酶本身結構、提高蛋白純度的方法，因此本發(fā)明提供并優(yōu)化了一種核酸酶序列來制備不帶蛋白標簽的核酸酶，蛋白酶酶切位點的引入可以利用對應的蛋白酶來切除蛋白標簽，而接頭序列能提高蛋白酶酶切回收率。

4、進一步地，所述蛋白標簽包括his、mbp、gst、myc、ha和sumo的任意一種或多種；所述編碼蛋白酶酶切位點的序列包含l-v-p-r▼g-s(凝血酶)、d-d-d-d▼k(腸激酶)、l-e-v-l-f-q▼g-p(prescission蛋白酶)、exxyxq▼(g/s)(tev酶)的一種或多種；所述蛋白接頭序列包含(ggggs)n、(eaaak)n、(g)n和(xp)n的一種或多種，所述n為大于或等于1的整數(shù)。

5、可以理解的是，上述蛋白標簽、蛋白酶酶切位點和蛋白接頭序列可以根據(jù)目標蛋白的特性任意搭配，以達到最佳的制備方法。

6、在一些具體的實施例中，采用的蛋白酶酶切位點和蛋白接頭序列分別是tev酶的酶切位點(enlyfq▼g)和ggggs；

7、進一步地，所述序列元件組合順序為蛋白標簽-蛋白酶酶切位點-核酸酶-蛋白酶酶切位點-蛋白標簽、蛋白標簽-蛋白酶酶切位點-蛋白接頭序列-核酸酶-蛋白接頭序列-蛋白酶酶切位點-蛋白標簽或蛋白標簽-蛋白酶酶切位點-蛋白接頭序列-核酸酶-蛋白接頭序列-蛋白酶酶切位點-蛋白標簽-蛋白標簽中的任意一種。

8、優(yōu)選地，所述序列元件組合順序為蛋白標簽-蛋白酶酶切位點-蛋白接頭序列-核酸酶-蛋白接頭序列-蛋白酶酶切位點-蛋白標簽-蛋白標簽，在本發(fā)明中對應的是pet28b-nuca-linker-tev-his序列，所述序列的具體序列如序列表seq?id?no:1所示。

9、在一些具體的實施例中，tev酶切位點的引入會降低核酸酶的純化效率，這可能是tev酶切位點的引入阻礙了核酸酶結合到鎳柱上，從而降低了純化效率，而新增his標簽增加了核酸酶與鎳柱之間的相互作用力，繼而能彌補tev酶切位點對純化效率的影響。

10、在一些優(yōu)選的實施例中，在核酸酶的c端增加his標簽，以防止所述新增的his標簽影響核酸酶分泌；增加his標簽的數(shù)目不宜超過1個，即未經tev酶切的核酸酶最多帶有3個his標簽，因為his標簽的數(shù)目越多，核酸酶與ni柱的結合力越強，越不容易洗脫下來，繼而影響蛋白的得率。綜上所述，最佳的序列元件組合為his-tev酶切位點-ggggs-核酸酶-ggggs-tev酶切位點-his-his。

11、另一方面，本發(fā)明提供了一種核酸酶的制備方法，采用編碼核酸酶的序列制備核酸酶，所述編碼核酸酶的序列如上所述。

12、進一步地，所述的制備方法的步驟如下：

13、a.將編碼核酸酶的序列構建到表達載體上；

14、b.誘導蛋白表達，且純化蛋白；

15、c.用蛋白酶酶切核酸酶蛋白；

16、d.純化并濃縮步驟c中的酶切產物。

17、進一步地，所述步驟b中蛋白表達為原核表達系統(tǒng)或真核表達系統(tǒng)。在一些具體的實施例中，選用的是原核表達系統(tǒng)。

18、進一步地，所述步驟b和步驟c中純化蛋白的方式包括層析、沉淀法、膜分離技術和離心法的任意一種或多種。

19、進一步地，所述制備方法的具體步驟如下：

20、a.將編碼核酸酶的核苷酸序列構建到pet-28b原核表達載體中；

21、b.將步驟a所述的重組載體轉入大腸桿菌表達菌株中，擴大培養(yǎng)后，用iptg誘導融合核酸酶蛋白的表達，并用層析法純化，所述大腸桿菌表達菌株為bl21(de3)、rosetta、origamib(de3)的任意一種或多種。

22、c.用tev蛋白酶切除步驟b中純化好的融合核酸酶蛋白的his標簽，然后再用ni柱吸附酶切反應液里游離的his-tev融合蛋白，使得核酸酶蛋白留在液體中；

23、d.收集步驟c中只含核酸酶的液體，并對其進行超濾濃縮。

24、另一方面，本發(fā)明提供了一種核酸酶序列用于制備提高不帶標簽核酸酶純度的試劑的用途。所述核酸酶序列原件組合順序為蛋白標簽-蛋白酶酶切位點-蛋白接頭序列-核酸酶-蛋白接頭序列-蛋白酶酶切位點-蛋白標簽-蛋白標簽，所述核酸酶序列在本發(fā)明命名為pet28b-nuca-linker-tev-his序列，具體序列具有序列表seq?id?no:1所示的序列。

25、本發(fā)明的有益效果包括：

26、1、通過一些蛋白表達元件的運用，如his標簽、柔性linker、tev酶切位點等，能夠暫時有效改變核酸酶的結構，使其有效折疊，從而獲得更高純度的蛋白；隨后，將蛋白標簽去除，最大限度還原核酸酶本身的結構；

27、2、本制備方法流程簡單，所需的儀器大眾化，且試劑耗材便宜，便能獲得高純度的核酸酶，從而降低了核酸酶的生產成本，間接地提高了生產利潤和產品競爭力；

28、3、最終生成的核酸酶產品不含his蛋白標簽，his標簽為常用的蛋白標簽，如果核酸酶的處理對象后續(xù)要用于pull-down、emsa等特異性蛋白結合實驗，若是核酸酶帶his標簽可能會導致實驗結果不可信；

29、4、本發(fā)明提供的制備方法也適用于其他酶的生產。