本發(fā)明屬于生物，具體涉及調(diào)控植物細(xì)胞伸長的基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、禾本科植物對人類生活至關(guān)重要，包括稻米、小麥、玉米和竹子等重要物種，竹子在竹亞科中有超過1400種全球物種（li?et?al.,?2013）。竹子被譽為世界上生長最快的植物，每天可以生長高達(dá)四英尺，高度超過100英尺。其卓越的物理和機械特性使其非常耐用，而地下的竹鞭可以在兩個月內(nèi)萌發(fā)成竹筍并發(fā)育為成熟竹稈（chen?et?al.,?2022;?cuiet?al.,?2012;?he?et?al.,?2013）。盡管已有廣泛的研究，但推動竹子快速生長的分子機制仍不充分理解。作為竹亞科中首個完成基因組測序的種類，毛竹（ phyllostachys? edulis）的基因組數(shù)據(jù)為未來研究提供了基礎(chǔ)資源（peng?et?al.,?2013;?zhao?et?al.,2018）。因此，毛竹是研究竹子快速生長分子基礎(chǔ)的理想模型。

2、鑒于竹子在生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和文化上的多重價值，以及其對快速生長機制的獨特展現(xiàn)，近年來，科學(xué)家們致力于通過基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及分子生物學(xué)手段深入挖掘調(diào)控植物細(xì)胞伸長，特別是竹子快速生長的關(guān)鍵基因。這些研究不僅旨在揭示竹子生長速度遠(yuǎn)超其他植物的分子機制，還期望將相關(guān)基因應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，以提高作物產(chǎn)量和資源利用效率。鑒于此，深入挖掘和鑒定竹子快速生長相關(guān)基因，利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)開展功能基因的研究和利用，不僅對竹子的發(fā)育生物學(xué)和育種具有重要意義，而且還可以為農(nóng)作物的種質(zhì)資源創(chuàng)新、遺傳改良提供寶貴的基因資源，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何調(diào)控植物細(xì)胞伸長、調(diào)控植物細(xì)胞大小、調(diào)控植物株高、調(diào)控植物葉片大小、培育株高改變的植物和/或培育葉片大小改變的植物。所要解決的技術(shù)問題不限于所描述的技術(shù)主題，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術(shù)主題。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了蛋白質(zhì)的應(yīng)用，所述應(yīng)用可為下述任一種：

3、a1）在調(diào)控植物細(xì)胞伸長中的應(yīng)用；

4、a2）在調(diào)控植物細(xì)胞大小中的應(yīng)用；

5、a3）在調(diào)控植物株高中的應(yīng)用；

6、a4）在調(diào)控植物葉片大小中的應(yīng)用；

7、a5）在培育株高改變的植物中的應(yīng)用；

8、a6）在培育葉片大小改變的植物中的應(yīng)用；

9、a7）在植物株高和/或葉片改良分子育種或植物的與株高和/或葉片相關(guān)的種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用；

10、所述蛋白質(zhì)名稱可為pedwf4，為下述任一種：

11、b1）氨基酸序列是seq?id?no.1的蛋白質(zhì)；

12、b2）將seq?id?no.1所示的氨基酸序列經(jīng)過氨基酸殘基的置換、缺失和/或添加得到的與b1）所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；

13、b3）在b1）或b2）的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)。

14、上述應(yīng)用中，所述蛋白質(zhì)可來源于毛竹（ phyllostachys?edulis）。

15、b2）中所述置換可為保守置換。

16、b3）中所述連接可通過肽鍵（peptide?bond）直接連接或通過接頭連接。

17、為了使b1）中所述蛋白質(zhì)pedwf4便于分離、純化、檢測和/或定位，可在由序列表中seq?id?no.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接標(biāo)簽蛋白。所述標(biāo)簽包括但不限于：gst（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽蛋白、trx（硫氧還蛋白）標(biāo)簽蛋白、氮利用底物a（nusa）標(biāo)簽蛋白、his標(biāo)簽蛋白（his-tag）、mbp（麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽蛋白、flag標(biāo)簽蛋白、sumo標(biāo)簽蛋白、ha（流感血凝素）標(biāo)簽蛋白、myc標(biāo)簽蛋白、lacz標(biāo)簽蛋白、cbd（纖維素結(jié)合域）標(biāo)簽蛋白、噬菌體t7蛋白激酶（t7pk）標(biāo)簽蛋白、gfp（綠色熒光蛋白）、cfp（青色熒光蛋白）、yfp（黃綠色熒光蛋白）、mcherry（單體紅色熒光蛋白）或avitag標(biāo)簽蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知如何根據(jù)期望目的選擇合適的標(biāo)簽蛋白。標(biāo)簽的使用不改變目的蛋白的功能，其目的在于分離、純化、檢測或示蹤，因此適用于本技術(shù)的標(biāo)簽蛋白并不局限于特定種類。標(biāo)簽可以通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)裂解法或酶法（如引入蛋白酶切位點利用tev蛋白酶切割去除標(biāo)簽）與目的蛋白進(jìn)行分離。

18、所述應(yīng)用可通過上調(diào)或下調(diào)所述蛋白質(zhì)pedwf4的含量和/或活性來實現(xiàn)。

19、進(jìn)一步地，所述應(yīng)用可包括通過上調(diào)所述蛋白質(zhì)pedwf4的含量和/或活性（如過表達(dá)）來促進(jìn)植物細(xì)胞伸長、增加植物細(xì)胞大小、增加植物株高、增加植物葉片大小、培育株高增加的植物和/或培育葉片增大的植物。

20、進(jìn)一步地，所述應(yīng)用可包括通過上調(diào)所述蛋白質(zhì)pedwf4的含量和/或活性來促進(jìn)植物細(xì)胞伸長、增加植物細(xì)胞大小、增加植物株高、增加植物葉片大小、培育株高增加的植物和/或培育葉片增大的植物。

21、進(jìn)一步地，所述上調(diào)可通過過表達(dá)所述蛋白質(zhì)pedwf4的基因（ pedwf4基因）來實現(xiàn)。

22、進(jìn)一步地，所述應(yīng)用可包括通過下調(diào)所述蛋白質(zhì)pedwf4的含量和/或活性來抑制植物細(xì)胞伸長、減小植物細(xì)胞大小、降低植物株高、減小植物葉片大小、培育株高降低的植物和/或培育葉片減小的植物。

23、進(jìn)一步地，所述下調(diào)可通過降低蛋白質(zhì)pedwf4的基因（ pedwf4基因）的表達(dá)量（例如敲除或沉默 pedwf4基因）來實現(xiàn)。

24、本發(fā)明還提供了與所述蛋白質(zhì)pedwf4相關(guān)的生物材料的應(yīng)用，所述應(yīng)用可為下述任一種：

25、c1）在調(diào)控植物細(xì)胞伸長中的應(yīng)用；

26、c2）在調(diào)控植物細(xì)胞大小中的應(yīng)用；

27、c3）在調(diào)控植物株高中的應(yīng)用；

28、c4）在調(diào)控植物葉片大小中的應(yīng)用；

29、c5）在培育株高改變的植物中的應(yīng)用；

30、c6）在培育葉片大小改變的植物中的應(yīng)用；

31、c7）在植物株高和/或葉片改良分子育種或植物的與株高和/或葉片相關(guān)的種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用；

32、所述生物材料可為下述任一種：

33、d1）編碼所述蛋白質(zhì)pedwf4的核酸分子；

34、d2）抑制或降低所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因表達(dá)的核酸分子；

35、d3）含有d1）或d2）所述核酸分子的表達(dá)盒；

36、d4）含有d1）或d2）所述核酸分子的重組載體、或含有d3）所述表達(dá)盒的重組載體；

37、d5）含有d1）或d2）所述核酸分子的重組微生物、或含有d3）所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有d4）所述重組載體的重組微生物；

38、d6）含有d1）或d2）所述核酸分子的重組宿主細(xì)胞、或含有d3）所述表達(dá)盒的重組宿主細(xì)胞、或含有d4）所述重組載體的重組宿主細(xì)胞；

39、d7）含有d1）或d2）所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織、或含有d3）所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；

40、d8）含有d1）或d2）所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有d3）所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官。

41、進(jìn)一步地，所述生物材料均可表達(dá)d1）或d2）所述核酸分子。

42、上述應(yīng)用中，d1）所述核酸分子可為編碼序列或核苷酸序列是seq?id?no.2的dna分子。

43、seq?id?no.2所示的dna分子為 pedwf4基因的編碼序列（cds），其編碼氨基酸序列為seq?id?no.1的蛋白質(zhì)pedwf4。

44、d1）所述核酸分子還可包括在seq?id?no.2所示核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)密碼子偏好性改造得到的核酸分子。

45、本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。所述核酸分子可為編碼所述蛋白質(zhì)pedwf4的基因及其調(diào)控序列形成的核酸分子。

46、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定點突變（包括寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變、pcr介導(dǎo)的定點突變和盒式突變等）或定向進(jìn)化（包括易錯pcr、dna改組和體外隨機引發(fā)重組等）的方法，對本發(fā)明的編碼蛋白質(zhì)pedwf4的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工改造的、與本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)pedwf4的核苷酸序列（如seq?id?no.2）具有75％或75％以上同一性的核苷酸序列，只要編碼蛋白質(zhì)pedwf4且具有與蛋白質(zhì)pedwf4相同的功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

47、本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)pedwf4的基因（ pedwf4基因）可以為任意能夠編碼蛋白質(zhì)pedwf4的核苷酸序列?？紤]到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。

48、編碼所述蛋白質(zhì)pedwf4的核酸分子的序列既可為 pedwf4基因的cds序列，也可以是 pedwf4基因的cdna序列，也可為 pedwf4基因的基因組基因序列。

49、可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有 pedwf4基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括但不限于雙元表達(dá)載體（如pbi系列載體（如pbi121）、pbin系列載體（如pbin19）、pcambia系列載體（如pcambia1300載體）、ppzp系列載體、pgreen系列載體、pbibac系列載體、pski015載體、pski074載體、pri101-an載體等）和共整合載體（可通過在中間載體中以同源重組或克隆方式插入與ti質(zhì)?；蚱鋮^(qū)段同源的區(qū)段來構(gòu)建）。所述植物表達(dá)載體含有外源基因表達(dá)所需的元件如啟動子、多克隆位點、終止子、核糖體結(jié)合位點等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3'端，如包括但不限于農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)（ti）質(zhì)?；颍ㄈ珉僦铣擅竛os基因）、植物基因（如大豆貯藏蛋白基因）3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。

50、使用 pedwf4基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，包括但不限于花椰菜花葉病毒（camv）35s啟動子、玉米泛素啟動子（ubi）、水稻肌動蛋白啟動子（actin）、emu啟動子、玉米 adhl基因啟動子、水稻 rbcs基因啟動子、番茄 rbcs基因啟動子、馬鈴薯 pinⅱ基因啟動子，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強子,包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。

51、為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入包括但不限于可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（ gus基因、熒光素酶基因 、gfp基因等）、抗生素抗性基因（卡那霉素抗性基因kanr、新霉素抗性基因 neo、潮霉素抗性基因 hyg、氯霉素抗性基因 cat、鏈霉素抗性基因 str、博來霉素抗性基因 ble等）或是除草劑抗性基因（ bar基因、草甘膦抗性標(biāo)記基因 epsps、綠黃隆抗性標(biāo)記基因 als等）。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接篩選轉(zhuǎn)化植株。

52、在本發(fā)明的一個或多個實施方案中，所述重組載體為pri101- 35s:: pedwf4。所述重組載體pri101- 35s:: pedwf4是將pri101-an載體的 kpnⅰ和 ecorⅰ識別位點間的片段（小片段）替換為核苷酸序列是seq?id?no.2的dna片段，保持pri101-an載體的其他核苷酸序列不變，得到的重組表達(dá)載體。

53、本文d2）中所述抑制或降低所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因表達(dá)的核酸分子可以是通過基因水平上的表達(dá)調(diào)控來抑制所述蛋白質(zhì)pedwf4的活性和/或降低所述蛋白質(zhì)pedwf4的含量的任何核酸分子。所述基因水平上的表達(dá)調(diào)控可包括染色質(zhì)水平（如組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)）、轉(zhuǎn)錄水平（如啟動子、轉(zhuǎn)錄因子、共調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)）、轉(zhuǎn)錄后水平（如rna剪接、microrna調(diào)節(jié)）和翻譯后水平（如泛素化、sumo化、乙?；⑻腔?、磷酸化、甲基化、nedd8修飾等）上的表達(dá)調(diào)控等。

54、進(jìn)一步地，所述抑制或降低所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因表達(dá)的核酸分子可包括抑制所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、轉(zhuǎn)錄后修飾和/或翻譯后修飾的核酸分子。

55、進(jìn)一步地，所述抑制或降低所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因表達(dá)的核酸分子包括通過基因敲減技術(shù)、基因編輯技術(shù)和/或基因敲除技術(shù)使所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因缺失或失活的核酸分子。

56、進(jìn)一步地，利用基因敲減技術(shù)（包括rna干擾技術(shù)、morpholino干擾技術(shù)、反義核酸技術(shù)和核酶技術(shù)等）、基因編輯技術(shù)（包括鋅指核酶基因編輯技術(shù)、talen基因編輯技術(shù)和crispr基因編輯技術(shù)等）或基因敲除技術(shù)（包括完全基因敲除和條件型基因敲除）抑制基因表達(dá)、沉默或敲除基因是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如：可以利用靶向所述蛋白質(zhì)pedwf4編碼基因的shrna、sirna或mirna從轉(zhuǎn)錄后水平或翻譯水平使基因表達(dá)失活或基因沉默。也可以利用含有sgrna和cas蛋白的crispr-cas系統(tǒng)對目標(biāo)基因進(jìn)行敲除。在本發(fā)明的一些實施方案中，是利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)來敲除植物中的 pedwf4基因。

57、進(jìn)一步地，所述抑制或降低所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因表達(dá)的核酸分子可包括（1）rna干擾技術(shù)中所使用的雙鏈rna（dsrna）、小干擾rna（sirna）、微小rna（mirna）和短發(fā)夾rna（shrna）等；（2）反義核酸技術(shù)中所使用的反義rna（asrna）和反義寡核苷酸（aon）等；（3）基因編輯技術(shù)中所使用的grna和sgrna等；（4）適體（aptamer）和核酶（ribozyme）等。

58、上述應(yīng)用中，d2）所述核酸分子可為sgrna或含有所述sgrna的crispr/cas9系統(tǒng)，所述sgrna的靶序列可如seq?id?no.3所示。

59、進(jìn)一步地，所述sgrna的核苷酸序列可如seq?id?no.4的第378-494位所示。所述sgrna的編碼dna的核苷酸序列可如seq?id?no.5的第378-494位所示。

60、本發(fā)明還提供了一種培育株高增加和/或葉片變大的植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白質(zhì)pedwf4的含量和/或活性，得到株高高于所述目的植物和/或葉片大于所述目的植物的植物。

61、上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白質(zhì)pedwf4的含量和/或活性是通過提高目的植物中所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因的表達(dá)量來實現(xiàn)。

62、所述提高目的植物中所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因的表達(dá)量可通過下述至少一種方式實現(xiàn)：

63、m1）增加所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因的拷貝數(shù)；

64、m2）將所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因置于強啟動子的驅(qū)動下表達(dá)；

65、m3）增加所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因的調(diào)控元件使其過表達(dá)，所述調(diào)控元件包括增強子元件、提高mrna穩(wěn)定性的元件、增強翻譯效率的元件和/或增強蛋白質(zhì)分泌的元件；

66、m4）增加所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因的核糖體結(jié)合位點；

67、m5）對所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化；

68、m6）通過改變dna甲基化或組蛋白乙酰化等表觀遺傳修飾，上調(diào)基因的表達(dá)。

69、進(jìn)一步地，所述m2）可通過將蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因的天然啟動子替換為強啟動子實現(xiàn)，也可通過在蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因上可操作地連接第二啟動子實現(xiàn)。

70、所述強啟動子包括但不限于t7啟動子、camv啟動子、sv40啟動子、sffv啟動子、ubq啟動子、ubi啟動子、rbcs啟動子、actin啟動子、emu啟動子、cyp450啟動子、adhl啟動子和pinⅱ啟動子。

71、所述增強子包括但不限于cmv增強子、sv40增強子和rsv增強子。

72、上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因的表達(dá)量可通過將所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因?qū)胨瞿康闹参飳崿F(xiàn)。

73、上述方法中，所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因的核苷酸序列可如seq?id?no.2所示。

74、進(jìn)一步地，所述提高目的植物中所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因的表達(dá)量可通過將seq?id?no.2所示的dna分子導(dǎo)入所述目的植物中實現(xiàn)。

75、本文所述培育株高增加和/或葉片變大的植物的方法可包括如下步驟：

76、（1）構(gòu)建包含編碼所述蛋白質(zhì)pedwf4的核酸分子（如seq?id?no.2）的重組載體；

77、（2）將步驟（1）構(gòu)建的重組載體導(dǎo)入目的植物中；

78、（3）經(jīng)篩選和鑒定獲得轉(zhuǎn)基因植物。

79、進(jìn)一步地，上述方法中，在所述步驟（3）之后還可包括步驟（4）：將所述轉(zhuǎn)基因植物與待改良植物雜交，得到后代轉(zhuǎn)基因植物，所述后代轉(zhuǎn)基因植物與所述轉(zhuǎn)基因植物（即作為親本的轉(zhuǎn)基因植物）表型基本一致。

80、所述表型基本一致可為與待改良植物相比，株高增加和/或葉片變大。

81、進(jìn)一步地，所述導(dǎo)入的方法包括但不限于：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、植物病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、基因槍法（也稱為微粒發(fā)射轟擊法或生物導(dǎo)彈法）、化學(xué)刺激法、電擊法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、顯微注射法、激光微束法、花粉管通道法、超聲波法、氣槍法和渦流法等。

82、進(jìn)一步地，所述導(dǎo)入的方法可為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。

83、進(jìn)一步地，所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)法可包括如下步驟：將步驟（1）構(gòu)建的重組載體導(dǎo)入（如可采用ca離子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、金屬陽離子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法等）農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌，將所述重組農(nóng)桿菌侵染目的植物的愈傷組織或外植體；經(jīng)鑒定將得到的陽性愈傷組織或外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得再生植株。

84、所述外植體包括但不限于種子、根、葉片、葉柄、子葉、子葉柄、下胚軸、莖段、莖尖分生組織、表皮薄壁細(xì)胞、塊莖、匍匐莖節(jié)段、胚性懸浮細(xì)胞和原生質(zhì)體等。

85、所述篩選和鑒定的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如可以通過pcr檢測、southern雜交、免疫印跡、northern雜交、酶聯(lián)免疫吸附試驗（elisa）、功能性鑒定（測試選擇標(biāo)記基因和目的基因的存在）和/或原位雜交等技術(shù)鑒定已轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株（包括轉(zhuǎn)基因后代材料）。

86、本發(fā)明還提供了一種培育株高降低和/或葉片變小的植物的方法，所述方法包括降低目的植物中所述蛋白質(zhì)pedwf4的含量和/或活性，得到株高低于所述目的植物和/或葉片小于所述目的植物的植物。

87、上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白質(zhì)pedwf4的含量和/或活性是通過降低目的植物中所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因的表達(dá)量來實現(xiàn)。

88、上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)量可以是利用crispr/cas9系統(tǒng)進(jìn)行，所述crispr/cas9系統(tǒng)包括本文中所述的sgrna。

89、sgrna包括識別區(qū)和框架區(qū)（scaffold）。框架區(qū)負(fù)責(zé)與cas蛋白結(jié)合，識別區(qū)負(fù)責(zé)與目標(biāo)基因的靶點結(jié)合，引導(dǎo)cas蛋白到達(dá)靶點。

90、進(jìn)一步地，所述sgrna靶向 pedwf4基因，所述sgrna的識別區(qū)的核苷酸序列可如seqid?no.4的第378-401位所示。所述sgrna的核苷酸序列可如seq?id?no.4的第378-494位所示所示。

91、進(jìn)一步地，所述crispr/cas9系統(tǒng)還包括cas9蛋白。

92、進(jìn)一步地，本文所述cas9蛋白不限于特定的某一種蛋白，只要能與本發(fā)明sgrna配合使用即可。

93、進(jìn)一步地，本文所述cas9蛋白包括化膿鏈球菌（ streptococcus?pyogenes）cas9（spcas9，ii-a亞型）、spcas9?hf（高保真）、缺刻酶cas9（ncas9）、金黃色葡萄球菌（ staphylococcus?aureus）cas9（sacas9，ii-a亞型）、腦膜炎奈瑟氏球菌（ neisseria? meningitidis）cas9（nmcas9，ii-c亞型）、新兇手弗朗西斯菌（ francisella?novicida）cas9（fncas9，ii-b亞型）、嗜熱鏈球菌（ streptococcus?thermophilus）cas9（st1cas9、st3cas9）、空腸彎曲桿菌（ campylobacter?jejuni）cas9（cjcas9）和密螺旋體（ treponemasp.）cas9，以及其他生物體的cas9直系同源物但不限于此。所述cas9蛋白還可包括高保真cas9突變體（如：spcas9-hf1、espcas9-1.1和truecut??hifi?cas9蛋白）等。

94、本發(fā)明的方法可以用本領(lǐng)域已知的任何cas9蛋白實施。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明實施例原理的前提下，可以對cas9蛋白的編碼序列做出合適的選擇。

95、進(jìn)一步地，利用crispr/cas9系統(tǒng)降低目的植物中所述蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因的表達(dá)量可通過使目的植物細(xì)胞中的 pedwf4基因與本文所述的sgrna和cas9蛋白接觸來實現(xiàn)。

96、進(jìn)一步地，所述接觸的步驟可通過如下（1）或（2）進(jìn)行：

97、（1）直接將本文所述的sgrna導(dǎo)入所述目的植物細(xì)胞，或先將編碼本文所述sgrna的dna分子構(gòu)建到表達(dá)載體中再導(dǎo)入所述目的植物細(xì)胞；

98、（2）直接將cas9蛋白或cas9蛋白的mrna導(dǎo)入所述目的植物細(xì)胞，或先將編碼所述cas9蛋白的dna分子構(gòu)建到表達(dá)載體中再導(dǎo)入所述目的植物細(xì)胞，或?qū)as9蛋白與穿膜肽融合后，通過穿膜肽引入所述目的植物細(xì)胞。

99、所述穿膜肽用于促進(jìn)與其融合的cas9蛋白被細(xì)胞攝取和吸收，并在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能。合適的穿膜肽不局限于特定種類，只要能實現(xiàn)攜帶cas9蛋白穿膜、內(nèi)化的目的即可。所述穿膜肽包括但不限于人類免疫缺陷病毒hiv的轉(zhuǎn)錄反式激活因子tat（tat肽）、果蠅同源異型轉(zhuǎn)錄因子antp、單純皰疹病毒1型（hsv-1）轉(zhuǎn)錄因子vp22以及人工合成的多聚精氨酸和多聚賴氨酸。進(jìn)一步地，所述穿膜肽包含至少5個精氨酸或賴氨酸殘基，并且所述穿膜肽的總長度為5-30個氨基酸。

100、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知：cas9蛋白、cas9蛋白mrna、cas9表達(dá)載體（含有且表達(dá)編碼cas9蛋白的dna分子的載體）、sgrna、sgrna表達(dá)載體（含有且表達(dá)編碼sgrna的dna分子的載體）可以通過本領(lǐng)域中已知的各種方法轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，如化學(xué)刺激法（包括peg、磷酸鈣、氯化鈣處理等方法）、電擊法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、顯微注射法、基因槍法（也稱微粒轟擊法）、激光微束法、花粉管通道法、超聲波法、氣槍法和渦流法等，還可以載體為媒介將目的基因轉(zhuǎn)入植物受體細(xì)胞，如農(nóng)桿菌ti質(zhì)粒載體（包括ti質(zhì)粒衍生的載體如共整合載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)）介導(dǎo)法。

101、當(dāng)使用表達(dá)載體遞送sgrna與cas9蛋白時，sgrna與cas9蛋白可以連接在不同的表達(dá)載體中表達(dá)，也可以連入同一個表達(dá)載體中表達(dá)。

102、進(jìn)一步地，所述培育株高降低和/或葉片變小的植物的方法可包括如下步驟：

103、（1）將編碼sgrna的dna分子構(gòu)建到cas9表達(dá)載體中，得到crispr/cas9基因編輯載體；

104、（2）將所述crispr/cas9基因編輯載體導(dǎo)入目的植物中；

105、（3）經(jīng)篩選和鑒定獲得 pedwf4基因敲除的轉(zhuǎn)基因植物，即為所述株高降低和/或葉片變小的植物。

106、進(jìn)一步地，所述導(dǎo)入可通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入，可包括如下步驟：將所述crispr/cas9基因編輯載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌；將所述重組農(nóng)桿菌侵染玉米的愈傷組織或外植體；經(jīng)鑒定將得到的陽性愈傷組織或外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得再生植株。

107、進(jìn)一步地，編碼sgrna的dna分子的核苷酸序列可如seq?id?no.5的第378-494位所示所示。

108、進(jìn)一步地，所述cas9表達(dá)載體含有cas9基因，能夠表達(dá)cas9蛋白。進(jìn)一步地，所述cas9表達(dá)載體還可含有下述元件中的一種或多種：復(fù)制起始點（ori）、啟動子（如u6啟動子）、增強子（如cag增強子）、標(biāo)簽（如flag標(biāo)簽）、終止子（如bgh?poly(a)?terminator）、抗性基因（如kana抗生素抗性基因、氨芐抗性基因）、抗性基因的啟動子、篩選基因（如bar基因）、篩選基因的啟動子、cas9基因的啟動子（如ubi啟動子）。

109、所述cas9表達(dá)載體可以通過商購獲得，例如本發(fā)明一個實施方案中使用的pc1300-ubi::cas9載體，以及pbue411載體等。在設(shè)計出靶向目標(biāo)基因的sgrna后，能夠很方便地將編碼sgrna的dna分子插入到商業(yè)化cas9表達(dá)載體中，同時表達(dá)cas9蛋白和sgrna，進(jìn)而對目標(biāo)基因進(jìn)行編輯。此外，也可采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法來構(gòu)建cas9表達(dá)載體，例如可以化膿鏈球菌基因組為模板，擴增cas9基因，然后將cas9基因克隆到骨架表達(dá)載體（如pet28a、pet32a等）中，獲得cas9表達(dá)載體。

110、本發(fā)明所述培育株高降低和/或葉片變小的植物的方法還可包括將本文上述任一所述方法獲得的株高低于所述目的植物和/或葉片小于所述目的植物的植物與待改良植物雜交，得到后代轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述后代轉(zhuǎn)基因植物與所述株高低于所述目的植物和/或葉片小于所述目的植物的植物（即作為親本的轉(zhuǎn)基因植物）表型基本一致。所述表型基本一致可為與待改良植物相比，株高降低和/或葉片變小。

111、本文所述植物可為下述任一種：

112、e1）單子葉植物或雙子葉植物；

113、e2）禾本科植物或十字花科植物。

114、進(jìn)一步地，所述植物可為竹亞科植物（如毛竹）或擬南芥屬植物（如擬南芥）。

115、本文所述調(diào)控可為上調(diào)（促進(jìn)或增加）或下調(diào)（抑制、降低或減小）。

116、本文中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含在目的植物中導(dǎo)入所述 pedwf4基因或在目的植物中敲除所述 pedwf4基因得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。

117、本文中，所述目的植物可為含有pedwf4蛋白的編碼基因的目的植物。

118、本文所述 pedwf4基因既可以是內(nèi)源基因也可以是外源基因。

119、本發(fā)明公開了蛋白質(zhì)pedwf4及其編碼基因在調(diào)控植物細(xì)胞伸長、植物細(xì)胞大小、植物株高和植物葉片大小中的應(yīng)用。實驗證明，將植物中蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因進(jìn)行過表達(dá)，則植物細(xì)胞顯示出明顯延長的細(xì)胞長度，且植物細(xì)胞的大小明顯增加，同時植物的株高和葉片大小均顯著增加。將植物中蛋白質(zhì)pedwf4的編碼基因進(jìn)行敲除后，則導(dǎo)致植物細(xì)胞長度顯著縮短，即顯著抑制了植物細(xì)胞的伸長。

120、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn) pedwf4基因及其編碼的蛋白質(zhì)在調(diào)控植物細(xì)胞伸長、植物細(xì)胞大小、植物株高和植物葉片大小中的應(yīng)用，為與株高和/或葉片相關(guān)的分子育種和種質(zhì)資源改良提供了一個良好的基因資源，為 pedwf4基因的應(yīng)用開拓了一個新的領(lǐng)域，豐富了調(diào)控細(xì)胞伸長的相關(guān)基因。本發(fā)明為作物遺傳改良和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力提升貢獻(xiàn)了理論基礎(chǔ)與實踐基礎(chǔ)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。