本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物，涉及石斛蘭 dhlcyb基因及其瞬時(shí)調(diào)控花色的應(yīng)用，尤其涉及一種利用 dhlcyb基因瞬時(shí)改變石斛蘭花色的方法。

背景技術(shù)：

1、石斛蘭為石斛屬（ dendrobium）植物，多數(shù)具有觀賞價(jià)值。石斛蘭花色艷麗，花型多樣，保鮮期長，在切花、盆花、胸花、花束、配餐花等方面得到廣泛應(yīng)用。商品石斛蘭的花色主要以紫紅色調(diào)為主，有少量黃色、綠色和白色等，缺少純紅色、橙色和天藍(lán)色等。根據(jù)前期研究，石斛蘭的花色素有花青素、類胡蘿卜素和葉綠素三大類?；ㄇ嗨厥鞘m花中的主要色素，控制紫紅、粉紅、桃紅等顏色的形成。類胡蘿卜素是黃色花中的主要色素，而花青素和類胡蘿卜素疊加使花色呈棕紅色。培育新奇的花色以及著色模式是石斛蘭花色育種研究的熱點(diǎn)，而生物育種將為石斛蘭花色育種提供更多的可能。

2、類胡蘿卜素是異戊二烯代謝產(chǎn)物中最重要的類群，在水果、根和花中以不同的成分和含量存在，吸收可見光，導(dǎo)致黃色、橙色和紅色。植物中的類胡蘿素的生物合成始于異戊烯基焦磷酸鹽及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸酯，主途徑上的第一個(gè)限速酶是八氫番茄紅素合酶（psy）。接下來無色的八氫番茄紅素經(jīng)過一系列催化后形成紅色的全反式番茄紅素，該色素是番茄和西瓜等主要色素成分。番茄紅素的環(huán)化是類胡蘿卜素生物合成的一個(gè)重要分支點(diǎn)，該過程經(jīng)由兩種番茄紅素環(huán)化酶催化：番茄紅素- ε-環(huán)化酶（lcye）和番茄紅素- β-環(huán)化酶（lcyb）。番茄紅素經(jīng)lcye催化生成 δ-胡蘿卜素，經(jīng)lcyb催化生成兩端有 β-環(huán)的 β-胡蘿卜素。番茄紅素分子兩個(gè)末端分別被lcyb和lcye催化，形成有 β-環(huán)和 ε-環(huán)的 α-胡蘿卜素。因此 lcyb基因被認(rèn)為是改變類胡蘿卜素代謝流的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。目前未見觀賞石斛蘭中 lcyb基因的研究報(bào)道。

3、vigs（virus-induced?gene?silencing，病毒誘導(dǎo)的基因沉默）由于外源基因的導(dǎo)入，導(dǎo)致植物中與該外源基因高度同源的植物內(nèi)源mrna序列的特異性降解，進(jìn)而通過表型變異研究目標(biāo)基因功能。在菊花、百合、牡丹、三色堇、水仙等觀賞植物種都有比較成熟的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供 dhlcyb基因及其vigs?技術(shù)瞬時(shí)改變石斛蘭花色的應(yīng)用。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明第一方面提供了蛋白，為如下任一種：

3、a1）包括序列表中序列2所示的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)；

4、a2）將序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a1)?衍生的蛋白質(zhì)或與a1）所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同源性的蛋白質(zhì)；

5、a3)?將a1）所示蛋白質(zhì)的末端添加標(biāo)簽蛋白，得到的融合蛋白。

6、上文中，a1）具體為由序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。

7、第二方面，本發(fā)明提供了編碼第一方面所述蛋白的核酸分子。

8、上文所述核酸分子為如下任一種：

9、b1）編碼基因包括序列表中序列1所示的dna分子；

10、b2）在嚴(yán)格條件下與b1）限定的dna序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna分子；

11、b3）與b1）限定的dna序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna分子。

12、第三方面，本發(fā)明提供了含有第二方面所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒或重組菌。

13、第四方面，本發(fā)明提供了第一方面所述蛋白、第二方面所述核酸分子或第三方面所述的重組載體、表達(dá)盒或重組菌在調(diào)控石斛蘭花花色中的應(yīng)用。

14、第五方面，本發(fā)明提供了抑制第一方面所述蛋白的生物學(xué)功能的物質(zhì)或抑制第二方面所述核酸分子表達(dá)的物質(zhì)在如下任一種或者培育具有如下任一種表型的植株中的應(yīng)用：

15、c1）改變石斛蘭花花色；

16、c2）提高石斛蘭花中番茄紅素含量；

17、c3）提高石斛蘭花的花瓣紅色程度；

18、c4）使石斛蘭花單株形成不同花色。

19、上文提高石斛蘭花的花瓣紅色程度體現(xiàn)在花瓣色相 a*值提高。

20、上文所述應(yīng)用中，所述物質(zhì)為vigs載體；

21、所述vigs載體的作用靶序列為序列1第959-1062bp位或?qū)?yīng)于序列1第959-1062bp位，或序列1第1149–1297?bp位或?qū)?yīng)于序列1第1149–1297?bp位。

22、進(jìn)一步地，所述vigs載體為將序列1第959-1062bp位或?qū)?yīng)于序列1第959-1062bp位，或序列1第1149–1297?bp或?qū)?yīng)于序列1第1149–1297?bp位所示的片段插入pcymmv-pro60載體得到的載體。

23、第六方面，本發(fā)明提供了一種改變石斛蘭花花色的方法，其包括如下步驟：抑制石斛蘭花中第一方面所述蛋白的生物學(xué)功能或抑制石斛蘭花中第二方面所述核酸分子的表達(dá)，得到花色改變的石斛蘭花。

24、上文改變石斛蘭花花色的方法具體包括如下步驟：

25、d1）構(gòu)建vigs載體；所述vigs載體的作用靶序列為序列1或?qū)?yīng)于序列1第959-1062bp位或序列1或?qū)?yīng)于序列1第1149–1297?bp位；

26、d2）將所述vigs載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，得到重組菌；

27、d3)將所述重組菌導(dǎo)入待改變花色的石斛蘭的葉片中后，實(shí)現(xiàn)抑制石斛蘭花中第一方面所述蛋白的生物學(xué)功能或抑制石斛蘭花中第二方面所述核酸分子的表達(dá)，培養(yǎng)，得到花色改變的石斛蘭花。

28、上文所述方法中，所述花色改變的石斛蘭花為與所述待改變花色的石斛蘭相比，花色種類增多、花色的紅色程度增加和/或番茄紅素含量提高。

29、上文步驟d3）中，所述導(dǎo)入的時(shí)間為所述待改變花色的石斛蘭處于抽出10-15cm花序且花芽未開放時(shí)期。

30、上文中，所述待改變花色的石斛蘭為黃色的金公主。

31、第七方面，本發(fā)明提供了一種提高石斛蘭花中番茄紅素含量的方法，包括如下步驟：抑制石斛蘭花中第一方面所述蛋白的生物學(xué)功能或抑制石斛蘭花中第二方面所述核酸分子的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)提高石斛蘭花中番茄紅素含量。

32、上文各個(gè)方法中，所述抑制石斛蘭花中dhlcyb蛋白的生物學(xué)功能或抑制石斛蘭花中dhlcyb蛋白編碼基因表達(dá)為通過向石斛蘭花中導(dǎo)入vigs載體實(shí)現(xiàn)；

33、所述vigs載體為將序列1或?qū)?yīng)于序列1第959-1062bp位或序列1或?qū)?yīng)于序列1第1149–1297?bp位所示的片段插入pcymmv-pro60載體得到的載體。

34、本發(fā)明提供了 dhlcyb基因序列信息，以及用于基于 dhlcyb基因片段構(gòu)建的 dhlcyb-pcymmv-pro60重組vigs載體及其插入片段序列。本發(fā)明所提供的基因片段是從石斛蘭中獲得的，是 dhlcyb基因cds編碼區(qū)的一段序列，通過反轉(zhuǎn)錄rt-pcr，獲得了該基因片段，插入pcymmv-pro60載體構(gòu)建vigs載體后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，注射黃色花品種石斛蘭，21天左右開出第一朵花色變化的花后，此后花序上開出的每朵花均有花色變化，直至整朵花衰老凋謝，若注射50天以后還有未開放的花芽，則再開出的花顏色恢復(fù)正常。

35、本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明采用vigs沉默 dhlcyb基因，使石斛蘭花色改變效果顯著，且不同植株、不同花朵的表現(xiàn)各異，觀賞性強(qiáng)兼具趣味性。葉片注射，不損傷花朵，開花形態(tài)正常，無畸形?；ㄉ淖冃Ч志?，注射后20-25天可以開出第一朵花色變化的花，此后花序上開出的每朵花均有花色變化，直至整朵花衰老凋謝。