本發(fā)明涉及植物分子育種，具體為羊草抗旱性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、當(dāng)前，為了保障肉類糧食安全，牧業(yè)需要大量的土地用于生產(chǎn)牧草，加大對北方干旱、半干旱土地的利用是提高牧業(yè)產(chǎn)業(yè)規(guī)模、補充我國居民肉類糧食供給的關(guān)鍵舉措。而篩選和培育具有強抗旱能力的牧草資源，是配合實現(xiàn)這一目標(biāo)的重要環(huán)節(jié)。

2、羊草(leymus?chinensis)為禾本科多年生草本植物，因綿羊、山羊喜食，故名羊草，歷史上是中國東北、內(nèi)蒙古等北方干旱、半干旱草原地區(qū)的主要優(yōu)勢物種。羊草的根系發(fā)達(dá)，能夠深入土壤中吸收水分和養(yǎng)分，在干旱的環(huán)境下生長良好，是宜牧荒地的常見牧草。羊草富含蛋白質(zhì)、粗纖維、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分，能夠為牛、羊提供豐富的營養(yǎng)，促進其生長和發(fā)育，受到牧業(yè)生產(chǎn)者的廣泛認(rèn)可。然而，較草原其他競爭物種，幼苗階段的發(fā)育相對遲緩，且對干旱脅迫尤其敏感，成為其應(yīng)用的主要瓶頸。因此，選育抗旱能力突出的羊草資源，可有效擴大宜牧荒地面積、增加牧草產(chǎn)量、提高牧業(yè)產(chǎn)業(yè)規(guī)模。

3、雖然當(dāng)前已有針對禾本科植物開展的抗旱種質(zhì)篩選，然而禾本科是基于傳統(tǒng)林奈分類系統(tǒng)定義的一個非常廣泛和巨大的植物類群，不同物種間的耐旱篩選方式難以相互適用。以水稻為例，水稻和羊草雖同屬于禾本科植物，但二者在遺傳、生理和解剖等方面有諸多較大的差異，遺傳方面：水稻屬于禾本科稻屬稻種，是同源二倍體植物，含有24條染色體(2n＝2x＝24)，基因組大小約385mb，含有約4萬個編碼蛋白的基因；而羊草屬于禾本科賴草屬羊草種，是異源四倍體植物，含有28條染色體(2n＝4x＝28)，基因組大小約8gb，含有超過8萬個編碼蛋白的基因；生理方面：水稻起源于中國珠江中游，年均降雨量高達(dá)700-2400mm，年均溫度14～22℃，而羊草起源于歐亞大陸草原區(qū)東部，年均降雨量僅120-200mm，年均溫度僅-2～6℃，二者最適生長條件不同；解刨方面：羊草幼苗的葉片為針狀，氣孔密度高達(dá)90～170個/mm2，氣孔長度38～42μm，有根莖和沙套結(jié)構(gòu)，具備典型的旱生植物特征；而水稻葉片為帶狀，氣孔密度僅11～27個/mm2，氣孔長度僅9～16μm，展現(xiàn)出中生植物的特征。因此，二者間巨大的差異決定了適合于水稻的抗旱篩選方式不適合于羊草。

4、snp分子標(biāo)記在植物抗旱育種中起到了重要的輔助作用，然而，在抗旱羊草的育種工作中，缺乏合適的snp分子標(biāo)記。傳統(tǒng)的建立與抗旱性狀關(guān)聯(lián)的snp分子標(biāo)記的方法存在準(zhǔn)確性差、樣本通量不足、對人力物力需求大的特點，難以有效的應(yīng)用于種源數(shù)量龐大的植物的育種工作。中國羊草種源數(shù)量極其豐富，為了解決上述問題，急需開發(fā)出一種有效的、專門針對羊草的抗旱性狀相關(guān)聯(lián)的snp分子標(biāo)記。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了羊草抗旱性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記及應(yīng)用，為抗旱羊草的育種提供參考。

2、有鑒于此，本發(fā)明的方案為：

3、本發(fā)明的第一個方面在于，提出羊草抗旱性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記選自snp1、snp2、snp3和snp4中的一種；其中：

4、所述分子標(biāo)記snp1位于如seq?id?no：1所示的核苷酸序列的第220位堿基，具有c/g多態(tài)性；

5、所述分子標(biāo)記snp2位于如seq?id?no：2所示的核苷酸序列的第380、381位堿基，具有g(shù)c/ca多態(tài)性；

6、所述分子標(biāo)記snp3位于如seq?id?no：3所示的核苷酸序列的第277位堿基，具有t/g多態(tài)性；

7、所述分子標(biāo)記snp4位于如seq?id?no：4所示的核苷酸序列的第394、395、396位堿基，具有atg/ggc多態(tài)性。

8、進一步地，所述抗旱性狀包括干旱脅迫后存活率和生理生化性狀；所述生理生化性狀為葉片相對含水量下降斜率。

9、本發(fā)明的第二個方面在于，提出羊草抗旱性狀相關(guān)的分子標(biāo)記組合，所述分子標(biāo)記組合由snp1、snp2、snp3和snp4兩種以上組合而成。

10、進一步地，所述snp1標(biāo)記的基因型為cc和gg，snp2標(biāo)記的基因型為ggcc和ccaa，snp3標(biāo)記的基因型為tt和gg，snp4標(biāo)記的基因型為aattgg/ggggcc；

11、所述分子標(biāo)記組合按snp1～snp4依次為c、gc、t、atg純合基因型，即為cc-ggcc-tt-aattgg基因型組合時，對應(yīng)的羊草具有最強的抗旱能力；

12、所述單倍型分子標(biāo)記按snp1～snp4依次為gg、ccaa、gg、ggggcc純合基因型，即為gg-ccaa-gg-ggggcc基因型組合時，對應(yīng)的羊草具有最弱的抗旱能力。

13、本發(fā)明的第三個方面在于，提出用于擴增第二個方面所述分子標(biāo)記組合的引物組合，所述引物組合由分別用于擴增snp1～snp4的引物組成，其中：

14、擴增分子標(biāo)記snp1的引物包括如seq?id?no：5-6所示的核苷酸序列；

15、擴增分子標(biāo)記snp2的引物包括如seq?id?no：8-9所示的核苷酸序列；

16、擴增分子標(biāo)記snp3的引物包括如seq?id?no：11-12所示的核苷酸序列；

17、擴增分子標(biāo)記snp4的引物包括如seq?id?no：14-15所示的核苷酸序列。

18、優(yōu)選地，所述引物組合為：

19、擴增分子標(biāo)記snp1的引物核苷酸序列如seq?id?no：5-7所示；

20、擴增分子標(biāo)記snp2的引物核苷酸序列如seq?id?no：8-10所示；

21、擴增分子標(biāo)記snp3的引物核苷酸序列如seq?id?no：11-13所示；

22、擴增分子標(biāo)記snp4的引物核苷酸序列如seq?id?no：14-16所示。

23、本發(fā)明的第四個方面在于，提出包含第三個方面所述引物組合的檢測試劑或試劑盒。

24、本發(fā)明的第五個方面在于，提出第一個方面所述的snp分子標(biāo)記、第二個方面所述分子標(biāo)記組合的獲得方法，所述方法包括以下步驟：

25、基于rna-seq鑒定出受干旱脅迫上調(diào)的基因；

26、使用hi-tom尋找羊草總?cè)后w中受干旱脅迫上調(diào)的基因啟動子區(qū)域的snp位點；

27、預(yù)測snp突變導(dǎo)致的元件功能喪失；

28、使用hi-tom分析耐旱羊草種源，比較不同snp在抗旱群體與總?cè)后w中的占比；

29、對不同的snp類型進行權(quán)重評分，分析snp類型與抗旱性狀的關(guān)聯(lián)，獲得與羊草抗旱性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記。

30、本發(fā)明的第六個方面在于，提出第一個方面所述的snp分子標(biāo)記、第二個方面所述的分子標(biāo)記組合、第三個方面所述的引物組合、第四個方面所述的檢測試劑或試劑盒、第五個方面所述方法獲得的snp標(biāo)記或分子標(biāo)記組合在如下(1)至(6)任一方面中的應(yīng)用：

31、(1)鑒定或輔助鑒定羊草的抗旱能力；

32、(2)篩選或輔助篩選抗旱能力強的羊草新品種；

33、(3)羊草分子標(biāo)記輔助育種；

34、(4)制備鑒定或輔助鑒定羊草抗旱能力的產(chǎn)品；

35、(5)制備篩選或輔助篩選抗旱能力強的羊草新品種的產(chǎn)品；

36、(6)制備羊草分子標(biāo)記輔助育種的產(chǎn)品。

37、本發(fā)明的第七個方面，提出一種鑒定或篩選羊草抗旱能力的方法，所述方法包括檢測羊草如第一個方面所述snp分子標(biāo)記的多態(tài)性或基因型，或檢測如第二個方面所述分子標(biāo)記組合的基因型的步驟。

38、本發(fā)明的第八個方面，提出一種羊草遺傳改良的方法，所述方法包括繼代選育snp1分子標(biāo)記的cc基因型的純合子個體，淘汰該位點所有其他基因型個體的步驟；或繼代選育snp2分子標(biāo)記的ggcc基因型的純合子個體，淘汰該位點所有其他基因型個體的步驟；或繼代選育snp3分子標(biāo)記的tt基因型的純合子個體，淘汰該位點所有其他基因型個體的步驟；或繼代選育snp4分子標(biāo)記的aattgg基因型的純合子個體，淘汰該位點所有其他基因型個體的步驟；優(yōu)選地，所述方法包括繼代選育上述分子標(biāo)記組合的cc-ggcc-tt-aattgg基因型組合的個體，淘汰該標(biāo)記組合的所有其他基因型組合個體的步驟。

39、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下有益效果：

40、本發(fā)明所述提供的與羊草抗旱性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其組合，能夠在分子水平對羊草的抗旱性狀做出精準(zhǔn)評價，在羊草幼苗期精準(zhǔn)、高效地篩選抗旱樹種，縮短羊草育種周期。

41、本發(fā)明提供的鑒定或篩選抗旱能力強的羊草的方法，能夠早期、快速、低成本、有效的預(yù)測羊草的抗旱能力，為羊草分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了有效手段。

42、本發(fā)明提供的分子標(biāo)記或羊草遺傳改良方法，適用范圍廣，具有廣闊的應(yīng)用前景，能夠取得優(yōu)異的經(jīng)濟價值。