本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種用于增強豬流行性腹瀉病毒復(fù)制的多肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬流行性腹瀉病(porcine?epidemic?diarrhea，ped)是急性、高度傳染性腸道疾病，引起仔豬嘔吐、脫水及致死性水樣腹瀉。豬流行性腹瀉病毒(porcine?epidemicdiarrhea?virus，pedv)作為ped的病原，歸于冠狀病毒科甲型冠狀病毒屬，是由囊膜包裹的單股正鏈rna病毒，呈直徑為90-190nm左右的球形，囊膜上有花瓣狀纖突，間距較大，排列規(guī)則，皇冠狀。其基因組全長約為28kb，包括5’端加帽的非編碼區(qū)(5’-utr)，3’端加poly(a)尾的非編碼區(qū)(3’-utr)以及7個開放閱讀框(orfs)。orfs編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白即刺突(s)蛋白、包膜(e)蛋白、膜(m)蛋白、核衣殼(n)蛋白，1個輔助蛋白(orf3)，和16個非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp?1-16)。

2、pedv?n蛋白已被研究報道參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，包裹病毒rna基因組，與病毒rna復(fù)制位點動態(tài)相關(guān)，起著保護病毒基因組以及介導(dǎo)基因組轉(zhuǎn)移至出芽位點的作用。此外，pedv?n能夠抑制ifn-β的表達介導(dǎo)病毒的免疫逃逸，通過兩種方式實現(xiàn)：破壞rig-i/mda5級聯(lián)反應(yīng)；阻斷tbk1與irf3的相互作用。對pedv?n蛋白的研究有助于揭示病毒感染與傳播規(guī)律，對開發(fā)新的防疫手段具有重要意義。

3、在針對pedv的研究過程中，由于需要針對不同條件下病毒感染效果進行大量繁復(fù)測試和驗證工作，因此提供足量病毒用于實驗是前提條件。

4、pedv的分離一直是ped臨床診斷的“金標準”，科研人員對pedv進行病毒分離的做法通常是將發(fā)病豬的糞便、病變小腸樣本與磷酸鹽緩沖液混合，隨后凍融離心，取上清液在體外感染vero細胞，經(jīng)過連續(xù)的傳代、擴繁后純化得到pedv臨床株。該方法受限于pedv對環(huán)境較弱的抵抗力、較差的細胞適應(yīng)能力、胰蛋白酶依賴性及弱細胞間傳播力。

5、pedv減毒活疫苗因其高免疫原性的優(yōu)點在疫苗開發(fā)中廣泛研究。在減毒疫苗的制備中，目前科研人員主要通過兩種方式，一是將病毒分離、在體外連續(xù)傳代，使其表現(xiàn)出更高的病毒滴度、更低的致病力和較高的免疫原性。如pedv?cv777株第28代細胞培養(yǎng)物開發(fā)的減毒活疫苗，可為免疫后的仔豬提供80％以上的保護；二是基于pedv毒力因子與免疫相關(guān)表位的研究，利用pedv高效反向遺傳技術(shù)對病毒基因組進行人為修飾篩選，獲得更安全有效的pedv減毒疫苗候選株。

6、但是，在拯救pedv弱毒株的過程中，上述現(xiàn)行做法或研究成果都存在面臨低代次毒毒力弱、細胞適應(yīng)性差、難以傳代的問題，無法滿足實際應(yīng)用中大批量實驗對pedv病毒的需求。因此，有必要提出新的解決方案。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于抑制豬流行性腹瀉病毒復(fù)制的多肽及其應(yīng)用。

2、為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：

3、提供一種用于增強豬流行性腹瀉病毒復(fù)制的多肽，該多肽是靶向pedv復(fù)制階段的穿膜多肽，并以pedv的核衣殼n蛋白序列中第58位精氨酸作為靶點；該多肽命名為r58-wt多肽，其氨基酸序列如seq?id?no:1所示。

4、作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，該多肽的n端具有穿膜肽修飾，所述穿膜肽為ccps，其序列如seq?id?no:2所示。

5、本發(fā)明進一步提供了利用前述的多肽促進pedv-n蛋白表達的方法，是以該多肽預(yù)孵育ipec-j2、vero或st細胞，在感染pedv后再次加入與預(yù)孵育時等量的多肽，裂解細胞并收獲樣品，檢測細胞中pedv-n蛋白的表達情況。

6、作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，進行多肽預(yù)孵育時，所用多肽的濃度為10μg/ml。

7、本發(fā)明還提供了前述多肽在制備用于促進豬流行性腹瀉病毒復(fù)制的試劑中的應(yīng)用。

8、發(fā)明原理描述：

9、鑒于業(yè)內(nèi)現(xiàn)有針對pedv病毒的分離、擴繁以及減毒疫苗候選株制備的工作效果并不理想，本發(fā)明提出全新解決思路，提出通過設(shè)計一種用于增強pedv復(fù)制能力的多肽，實現(xiàn)增強病毒復(fù)制效率的目的。

10、申請人在研究過程中注意到，pedv結(jié)構(gòu)蛋白中的核衣殼(n)蛋白高度保守，并與基因組rna形成復(fù)合物，影響病毒rna的合成、包裝及病毒顆粒的組裝。pedv?n蛋白還具有延長細胞dna合成期(s期)、誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及抑制iii型ifn產(chǎn)生的作用。pedv的n蛋白的n端結(jié)構(gòu)域(ntd)介導(dǎo)rna結(jié)合，是影響n蛋白功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。此外，n蛋白所含精氨酸是一種參與多種生物過程的堿性氨基酸，能夠提供病毒感染過程中所需的關(guān)鍵營養(yǎng)素。

11、基于上述對n蛋白和精氨酸性能研究的成果，申請人的研究團隊明晰了pedv的感染調(diào)控機制，創(chuàng)新地提出以pedv的n蛋白中特定靶位的精氨酸做為pedv復(fù)制進程調(diào)控中心，為解決方案提供新的思路。在現(xiàn)有研究成果中，尚無關(guān)于利用核衣殼(n)蛋白和精氨酸的特性去調(diào)控pedv復(fù)制進程的明確記載。

12、為此，申請人針對pedv?n蛋白的n端結(jié)構(gòu)域(ntd)區(qū)域內(nèi)的精氨酸進行了深入研究和繁復(fù)篩選，最終證實了核衣殼蛋白第58位精氨酸(n-r58)決定pedv的復(fù)制能力，并在此基礎(chǔ)上進一步提出下述的多肽設(shè)計方案：

13、(1)以pedv?n蛋白的n端序列特征為基礎(chǔ)，以精氨酸為中心，并在其前后保留部分氨基酸。由于多肽的純度、反應(yīng)活性及制備難度受限于多肽的長度，一般以30個左右的氨基酸為宜。因此，本技術(shù)中除穿膜肽(11個氨基酸)外，目標多肽的長度設(shè)計為20個氨基酸。

14、(2)在確定多肽的氨基酸序列后，于n端插入穿膜肽序列用于輔助多肽進入細胞，最終合成多肽(命名為r58-wt)。

15、通過在pedv自然感染模型中的驗證，結(jié)果顯示本技術(shù)得到的r58-wt多肽能夠顯著顯著增強pedv的復(fù)制。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

17、1、本發(fā)明通過深入研究尋獲pedv?n蛋白的n端區(qū)域中影響病毒復(fù)制的關(guān)鍵位點，利用該位點在不同冠狀病毒中高度保守的特點，提出將其作為調(diào)整病毒復(fù)制進程的全新靶點。

18、2、本發(fā)明進一步基于新靶點提供了靶向pedv復(fù)制階段的穿膜多肽，該多肽在ipec-j2、vero、st細胞的pedv感染模型驗證實驗中表現(xiàn)的促進作用十分顯著，能夠完美解決在拯救pedv弱毒株過程中存在的低代次毒毒力弱、細胞適應(yīng)性差、難以傳代等問題。

19、3、本發(fā)明明確了pedv的核衣殼蛋白n端的保守精氨酸，在pedv復(fù)制過程中發(fā)揮的重要調(diào)控功能，在此基礎(chǔ)上設(shè)計靶向該位點的穿膜多肽能夠發(fā)揮促進病毒復(fù)制的功能。本發(fā)明的提出，進一步豐富了穿膜肽在增強病毒的復(fù)制能力、提升拯救效率過程中的應(yīng)用，并進一步為病毒疫苗候選株的制備發(fā)揮作用。

20、4、本發(fā)明也為科研人員在其他類似冠狀病毒的研究工作中，深入了解病毒感染調(diào)控規(guī)律、尋找防控新線索提供全新啟示。