本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種可穩(wěn)定表達(dá)重組膠原蛋白的畢赤酵母菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、膠原蛋白是生物高分子，動(dòng)物結(jié)締組織中的主要成分，也是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白。膠原蛋白是重要的生物活性材料，廣泛應(yīng)用于化妝品，醫(yī)藥等領(lǐng)域。

2、在現(xiàn)有技術(shù)中，膠原蛋白的來(lái)源包括動(dòng)物組織提取和微生物發(fā)酵法獲得。與天然膠原蛋白相比，微生物發(fā)酵法來(lái)源的膠原蛋白克服了傳統(tǒng)提取法存在的病毒隱患缺陷。目前用于發(fā)酵的宿主菌包括大腸桿菌、酵母菌等。

3、但是，目前用于重組ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的畢赤酵母菌株在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其存在發(fā)酵產(chǎn)物即重組ⅲ型膠原蛋白易降解和不穩(wěn)定等問(wèn)題。因此，亟需提供一種膠原蛋白表達(dá)更穩(wěn)定，活性更高的重組酵母菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可穩(wěn)定表達(dá)重組膠原蛋白的畢赤酵母菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)對(duì)畢赤酵母菌株進(jìn)行改造，使其表達(dá)重組膠原蛋白編碼基因，并進(jìn)一步優(yōu)化，敲除其分泌蛋白降解酶相關(guān)基因，得到的突變體表達(dá)的重組ⅲ型膠原蛋白更加穩(wěn)定，純度更高。本發(fā)明為提高重組膠原蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量和穩(wěn)定性提供了研究基礎(chǔ)和新途徑。

2、為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種可穩(wěn)定表達(dá)重組膠原蛋白的畢赤酵母菌株，所述菌株以畢赤酵母菌株為出發(fā)菌株，表達(dá)重組膠原蛋白編碼基因，敲除畢赤酵母中的分泌蛋白降解酶的基因yps1。

4、本發(fā)明構(gòu)建了一株膠原蛋白表達(dá)更穩(wěn)定，活性更高的重組酵母菌株。為提高重組膠原蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)和穩(wěn)定性提供了研究基礎(chǔ)和新途徑。

5、其中，yps1是編碼蛋白酶yap3的基因，yap3的作用位點(diǎn)位于單個(gè)或成對(duì)堿性氨基酸c末端處，由于這類位點(diǎn)在蛋白多肽中是極為常見(jiàn)的，這使得大部分外源蛋白在酵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)均遭受到蛋白酶yap3的降解作用；本發(fā)明中敲除yps1基因后能顯著提高外源蛋白的表達(dá)量，并且也并未對(duì)宿主的生長(zhǎng)速率產(chǎn)生明顯影響。

6、優(yōu)選地，所述畢赤酵母菌株為畢赤酵母菌株gs115。

7、本發(fā)明，本發(fā)明中以畢赤酵母菌株gs115為出發(fā)菌，gs115屬于組氨酸缺陷型菌株(his-)，適用于篩選帶有his4基因的表達(dá)載體。

8、優(yōu)選地，所述重組膠原蛋白編碼基因包括seq?id?no.1所示。

9、本發(fā)明中，所述重組膠原蛋白的編碼基因是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，優(yōu)化后的序列更適合在畢赤酵母菌株中表達(dá)。

10、優(yōu)選地，以質(zhì)?；蛘呷旧w整合的方式表達(dá)重組膠原蛋白編碼基因。

11、優(yōu)選地，所述質(zhì)粒包括ppic9k、pgapza或ppicza等。

12、本發(fā)明中ppic9k載體含有alpha因子分泌信號(hào)肽序列，能夠分泌表達(dá)外源蛋白基因；ppic9k載體還含有醇氧化酶-1(aox1)基因的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子，可以被甲醇誘導(dǎo)，使重組蛋白的提取和純化過(guò)程更加簡(jiǎn)單方便。

13、優(yōu)選地，所述敲除畢赤酵母中的分泌蛋白降解酶的基因yps1的方法包括：

14、采用crispr/cas9基因編輯方法針對(duì)yps1基因的靶序列構(gòu)建yps1基因編輯載體，將yps1基因編輯載體轉(zhuǎn)化到含有重組膠原蛋白編碼基因的畢赤酵母表達(dá)菌株中，將菌株中的yps1基因敲除。

15、優(yōu)選地，所述yps1基因編輯載體上包括：grna和hscas9。

16、優(yōu)選地，所述grna靶向的位點(diǎn)為yps1基因；所述grna對(duì)應(yīng)的dna序列包括seq?idno.3和seq?id?no.4所示。

17、本發(fā)明中，所述grna敲除效果很好，可以造成靶基因移碼突變，具有較好的靶向效果。

18、第二方面，本發(fā)明提供一種yps1基因編輯載體，所述載體上包括：grna和hscas9；所述grna靶向的位點(diǎn)為yps1基因；所述grna對(duì)應(yīng)的dna序列包括seq?id?no.3和seq?idno.4所示。

19、第三方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)重組膠原蛋白的載體，所述載體上包括重組膠原蛋白編碼基因。

20、第四方面，本發(fā)明提供一種可穩(wěn)定表達(dá)重組膠原蛋白的方法，所述方法包括：

21、采用第一方面所述的可穩(wěn)定表達(dá)重組膠原蛋白的畢赤酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物用疏水層析的四步法純化得到純凈的膠原蛋白。

22、優(yōu)選地，所述疏水層析的四步法純化包括如下步驟：

23、(1)平衡：采用平衡液線性流速?zèng)_洗層析柱直至ph、uv和cond檢測(cè)基線穩(wěn)定且與平衡緩沖液一致；

24、(2)上樣：上樣并收集上樣過(guò)程中的流穿組分；上樣結(jié)束后用平衡緩沖液沖洗，洗出未結(jié)合的物料，直到紫外檢測(cè)值降至初始值；

25、(3)洗雜：采用洗脫緩沖液和平衡緩沖液進(jìn)行洗雜，除去結(jié)合力弱的雜質(zhì)；

26、(4)洗脫：采用洗脫緩沖液和平衡緩沖液進(jìn)行洗脫，將目的蛋白洗脫下來(lái)，收集洗脫組分。

27、優(yōu)選地，步驟(1)中，所述平衡液按濃度計(jì)包括：19-20mm?pb，0.9-1m硫酸銨，ph7.9-8.0。19-20mm?pb例如可以是19mm、19.5mm或20mm等；0.9-1m硫酸銨例如可以是0.9m、0.95m或1m等；ph7.9-8.0例如可以是7.9或8.0等。

28、優(yōu)選地，步驟(1)中，所述線性流速為20-30ml/min，例如可以是20ml/min、23ml/min、25ml/min、27ml/min、29ml/min或30ml/min等，平衡液的用量為2.5-3.5倍柱體積，例如可以是2.5、2.7、2.9、3.0、3.1、3.3或3.5等。

29、優(yōu)選地，步驟(2)中，所述上樣量為1.25-1.5倍柱體積，例如可以是1.25、1.3、1.35、1.4、1.45或1.5等；所述上樣的流速為20-30ml/min，例如可以是20ml/min、22ml/min、24ml/min、25ml/min、26ml/min、28ml/min或30ml/min等。

30、在一種具體實(shí)施方式中，所述1.25-1.5倍柱體積為500-600ml。

31、優(yōu)選地，步驟(2)中，所述上樣的樣品為等體積混合的發(fā)酵液上清和平衡緩沖液。

32、優(yōu)選地，步驟(2)中，所述沖洗的流速為20-30ml/min，例如可以是20ml/min、22ml/min、24ml/min、25ml/min、26ml/min、28ml/min或30ml/min等，所述平衡緩沖液的用量為2-3倍柱體積，例如可以是2、2.5或3等。

33、優(yōu)選地，步驟(3)中，所述洗脫緩沖液和平衡緩沖液的體積比為(3-3.5):(6.5-7)，例如可以是3:6.5、3:7、3.5:6.5或3.5:7等。

34、優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液按濃度計(jì)包括：19-20mm?pb，例如可以是19mm、19.5mm或20mm等，ph7.9-8.0，例如可以是7.9或8.0等。

35、優(yōu)選地，步驟(3)中，所述洗雜的流速為20-30ml/min，例如可以是20ml/min、22ml/min、24ml/min、25ml/min、26ml/min、28ml/min或30ml/min等。

36、優(yōu)選地，步驟(4)中，所述洗脫緩沖液和平衡緩沖液的體積比為(6-6.5):(3.5-4)，例如可以是6:3.5、6:4、6.5:3.5或6.5:4等。

37、優(yōu)選地，步驟(4)中，所述洗脫的流速為20-30ml/min，例如可以是20ml/min、22ml/min、24ml/min、25ml/min、26ml/min、28ml/min或30ml/min等。

38、本發(fā)明中，上述四步法純化中增加上樣前處理，使用純化儀的預(yù)混器將樣品與平衡液混勻，提高了目的蛋白的穩(wěn)定性；精簡(jiǎn)洗雜和洗脫的工藝，使用少量平衡液和洗脫液即可成功洗雜和洗脫。

39、本發(fā)明中，洗脫蛋白后，還包括對(duì)層析柱進(jìn)行沖洗和保存。以15-20ml/min的速度，用至少2柱體積的1-1.2m?naoh洗滌色譜柱，去除填充柱中殘留的污染物，如脂質(zhì)、內(nèi)毒素、核酸等。再用5-10cv的蒸餾水以15-20ml/min的速度洗滌層析柱，沖洗至流出液ph中性，cond接近0，以去除naoh。最后用至少3cv的20％乙醇洗滌保存，以防止微生物生長(zhǎng)。

40、第五方面，本發(fā)明提供第一方面所述的可穩(wěn)定表達(dá)重組膠原蛋白的畢赤酵母菌株、第二方面所述的yps1基因編輯載體、第三方面所述的表達(dá)重組膠原蛋白的載體或第四方面所述的可穩(wěn)定表達(dá)重組膠原蛋白的方法在制備重組膠原蛋白中的應(yīng)用。

41、本發(fā)明所述的數(shù)值范圍不僅包括上述列舉的點(diǎn)值，還包括沒(méi)有列舉出的上述數(shù)值范圍之間的任意的點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

42、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

43、本發(fā)明構(gòu)建得到一株重組膠原蛋白產(chǎn)量和穩(wěn)定性顯著提升的菌株；并優(yōu)化疏水層析純化工藝，流程得到簡(jiǎn)化，縮短周期，并且膠原蛋白的回收率提升。