本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及與結(jié)腸癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥性相關(guān)的circ86591的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、腫瘤耐藥性分為原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥，前者是由腫瘤細(xì)胞不均一性介導(dǎo)的，細(xì)胞毒性化療藥物主要針對活躍增殖的細(xì)胞，而非活躍增殖的細(xì)胞會逃脫治療，并促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)。后者是指一開始對藥物敏感的腫瘤細(xì)胞群，在暴露藥物的過程中產(chǎn)生的。獲得性耐藥的機(jī)制包括腫瘤細(xì)胞中重要通路或者基因的改變，代償性致癌信號通路的反饋激活、表觀遺傳調(diào)控的耐藥性或者細(xì)胞外排轉(zhuǎn)運(yùn)泵的過度表達(dá)等。因此，腫瘤耐藥性是多種復(fù)雜因素導(dǎo)致的綜合結(jié)果。隨著多種藥物及單抗的聯(lián)合應(yīng)用，腫瘤反應(yīng)率逐步提高，但是耐藥性的出現(xiàn)仍然是結(jié)直腸癌(colorectal?cancer，crc)患者治療效果不佳的主要原因。因此尋找腫瘤耐藥新靶點(diǎn)對于改善crc患者的治療效果、評估患者的用藥方案以及預(yù)測耐藥事件的發(fā)生有著重要意義。

2、吉西他濱(gemcitabine，gem)是一種廣泛用于治療血液惡性腫瘤的核苷類似物相關(guān)的化療藥物，目前已成為治療晚期胰腺癌的常規(guī)化療藥物。gem聯(lián)合其他藥物或者單抗的治療方案(如與多柔比星聯(lián)合療法)也用于治療包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種癌癥。然而腫瘤耐藥會大大降低gem的治療潛力。在部分結(jié)腸癌患者中，gem在不同治療方案中的作用和效果有以下幾個方面：(1)固定劑量率gem注射，但是結(jié)果顯示通過固定劑量率輸注給藥的吉西他濱對經(jīng)過大量預(yù)處理的晚期結(jié)直腸癌患者的活性很小。不推薦在該患者人群中使用吉西他濱單藥治療。(2)聯(lián)合紫杉醇等藥物應(yīng)用。已有研究分析了gem聯(lián)合紫杉醇用于晚期結(jié)直腸癌三線治療的療效及安全性。研究發(fā)現(xiàn)，gem聯(lián)合紫杉醇的治療效果優(yōu)于單獨(dú)使用吉西他濱，觀察組的治療有效率更高，不良反應(yīng)發(fā)生率更低，且患者的生活質(zhì)量和滿意度也顯著提高。根據(jù)nccn結(jié)腸癌指南，gem也可以與其他化療藥物聯(lián)合使用，如folfox、folfiri、capeox等，用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。(3)在奧沙利鉑耐藥的結(jié)直腸癌患者中，gem被認(rèn)為是替代療法。有研究顯示，gem通過抑制akt和src/p38?mapk通路來抵抗化療耐藥性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡。對于對基于奧沙利鉑的方案(如folfox)沒有反應(yīng)的患者，吉西他濱可能是一種替代療法?？偠灾?，gem在結(jié)腸癌的臨床治療中占據(jù)重要位置，對其耐藥性的探究有助于更多結(jié)腸癌患者從中獲益。

3、眾多研究顯示一些異常表達(dá)的蛋白和rna會影響結(jié)腸癌細(xì)胞對gem的敏感性。例如，低表達(dá)的smurf1可以增加gem和順鉑誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞系hct116的細(xì)胞凋亡。長鏈非編碼rnaagap2-as1可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，并且提高細(xì)胞對gem的化療耐藥性。

4、antisense?noncodingrna?in?ink4?locus(anril)又被稱為cdkn2b-as是位于人類染色體9p21.3的cdkn2a/b基因座上的反義長鏈非編碼rna(long?non-coding?rna，lncrna)。anril基因包含至少21個外顯子，通過剪接可形成線性anril(linearanril，linanril)和環(huán)狀anril(circularanril，circanril)。腫瘤細(xì)胞中，anril上調(diào)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal?transformation，emt)，而下調(diào)anril則會抑制腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡和衰老。在代謝性疾病中，anril基因的多態(tài)性與2型糖尿病、動脈粥樣硬化、肥胖等相關(guān)。除了基因的多態(tài)性，circanril的表達(dá)水平與冠狀動脈疾病的風(fēng)險和嚴(yán)重程度密切相關(guān)。circanril已被發(fā)現(xiàn)有13個轉(zhuǎn)錄本(hsa_circcdkn2b-as_001-013)，分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，所處位置的不同提示研究者circanril發(fā)揮功能的多樣性。hsa_circcdkn2b-as_005通過與60s前核糖體組裝因子-pescadillo?homologue?1(pes1)結(jié)合從而調(diào)節(jié)核糖體前體rna的成熟，控制血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的核糖體生物合成和核仁應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖抑制，最終發(fā)揮對動脈粥樣硬化的保護(hù)作用。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，hsa_circcdkn2b-as_006通過結(jié)合mir-1258分子進(jìn)而調(diào)控runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(runt-related?transcription?factor?1，runx1)的表達(dá)，影響wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞的emt。在皮膚癌中，hsa-circ_0025039、hsa-circrna_006612、hsa-circrna_005537和circanril可以通過針對不同的分子靶點(diǎn)(cdk4、dab2ip、zeb1、mir-889和let-7c-3p)以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。但是眾多anril的轉(zhuǎn)錄本在結(jié)腸癌中的研究較少，且無統(tǒng)一性的結(jié)論。已有報道顯示敲降anril的表達(dá)水平會提高結(jié)直腸癌細(xì)胞對5-fu的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。相反地，上調(diào)anril的表達(dá)水平會明顯促進(jìn)細(xì)胞的化療耐藥性。但是目前尚無結(jié)腸癌對gem耐藥反應(yīng)與anril之間關(guān)系的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供與結(jié)腸癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥性相關(guān)的circ86591的應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。本發(fā)明通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，circ86591有望作為新的gem耐藥標(biāo)志物，從而開發(fā)新的藥物以克服細(xì)胞對gem的耐藥反應(yīng)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供檢測circ86591表達(dá)量的試劑在制備評估結(jié)腸癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥性的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述circ86591的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、進(jìn)一步的，所述circ86591的表達(dá)量降低，則所述結(jié)腸癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥性提高。

5、本發(fā)明還提供檢測circ86591表達(dá)量的試劑在篩選降低結(jié)腸癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥性的藥物中的應(yīng)用，所述circ86591的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

6、進(jìn)一步的，以所述藥物處理結(jié)腸癌細(xì)胞后，所述circ86591的表達(dá)量降低，則所述藥物不能作為降低結(jié)腸癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥性的候選藥物。

7、本發(fā)明還提供一種檢測結(jié)腸癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥性的方法，包括檢測所述結(jié)腸癌細(xì)胞中circ86591的表達(dá)量的步驟，若所述結(jié)腸癌細(xì)胞中circ86591的表達(dá)量降低，則所述結(jié)腸癌細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性提高；所述circ86591的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

8、本發(fā)明還提供一種評估藥物是否提高結(jié)腸癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥性的方法，包括以所述藥物處理結(jié)腸癌細(xì)胞后，檢測circ86591的表達(dá)量，若所述circ86591的表達(dá)量降低，則所述藥物提高了結(jié)腸癌細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性；所述circ86591的核苷酸序列如seqid?no.1所示。

9、本發(fā)明還提供circ86591作為藥物靶點(diǎn)在篩選治療結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用，所述藥物與吉西他濱聯(lián)合治療結(jié)腸癌；所述circ86591的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

10、進(jìn)一步的，若所述藥物作用于結(jié)腸癌細(xì)胞后，所述circ86591的表達(dá)量降低，則所述藥物不能作為與吉西他濱聯(lián)合使用治療結(jié)腸癌的候選藥物。

11、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

12、本發(fā)明通過設(shè)計合成circ86591的aso試劑以及構(gòu)建過表達(dá)circ86591的腺病毒載體，分別對不同的結(jié)腸癌細(xì)胞系中的circ86591進(jìn)行敲降和過表達(dá)，獲得了circ86591敲降和過表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞系，通過cck-8實(shí)驗(yàn)檢測敲降和過表達(dá)circ86591后，結(jié)腸癌細(xì)胞對gem藥物的細(xì)胞存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circ86591后，結(jié)腸癌細(xì)胞對gem的反應(yīng)無顯著差異；敲降circ86591后，結(jié)腸癌細(xì)胞對gem的耐藥性提高。

13、本發(fā)明通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，circ86591有望作為新的gem耐藥標(biāo)志物，從而開發(fā)新的藥物以克服細(xì)胞對gem的耐藥反應(yīng)。