本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種新型二肽合成酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、酰胺鍵是一個(gè)羧基(-cooh)與一個(gè)胺基(-nh)脫水縮合形成的鍵，化學(xué)式為-co-nh-，是天然產(chǎn)物中廣泛存在的結(jié)構(gòu)，它極大地豐富了產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性，并參與了初級(jí)和次級(jí)代謝中許多不同的生理過(guò)程。據(jù)統(tǒng)計(jì)，60％以上候選藥物的合成涉及酰胺鍵的合成，如臨床常用藥阿托伐他汀(atorvastatin)、對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen)和格列衛(wèi)(gleevec)等。由酰胺鍵連接形成的肽類化合物也顯示出許多重要的生物活性，如抗生素和信息素等活性，并在制藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上廣泛使用。其中，二肽類化合物除了為復(fù)雜肽類化合物提供合成前提，還具有其他生理和藥理活性。如廣泛使用的甜味劑阿斯巴甜(l-天冬氨酸-l苯丙氨酸)，具有和臨床常用抗抑郁藥地西泮活性相當(dāng)?shù)亩幕衔?酪氨酸-亮氨酸)，廣泛應(yīng)用于抗衰老化妝品中的l-肌肽(β-丙氨酸-l-組氨酸)，治療成人急性非淋巴細(xì)胞白血病的代表性分子百司他汀(異絲氨酸-亮氨酸)等。

2、酰胺鍵的化學(xué)合成反應(yīng)過(guò)程中需要用到有毒試劑和昂貴的偶聯(lián)反應(yīng)催化劑，而且大多數(shù)情況下存在多個(gè)活性基團(tuán)，“基團(tuán)保護(hù)-偶聯(lián)-脫保護(hù)”的過(guò)程使得合成途徑變得復(fù)雜和產(chǎn)率低。因此，更高效、低廉、環(huán)保和產(chǎn)物單一的酶促反應(yīng)成為酰胺鍵合成的更優(yōu)選擇。這些酶具有獨(dú)特的底物特異性和催化特性，目前所報(bào)道的二肽合成酶大多識(shí)別天然氨基酸底物且構(gòu)型較為單一，對(duì)自然界中酰胺合酶的持續(xù)發(fā)現(xiàn)和表征，將擴(kuò)大這些酶催化所利用的底物范圍，豐富二肽類化合物庫(kù)，為藥物的發(fā)現(xiàn)和分子設(shè)計(jì)、為工業(yè)上和藥學(xué)上有價(jià)值的肽類產(chǎn)品的產(chǎn)生提供有效的工具。

3、因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開(kāi)發(fā)一種具有底物寬泛性和構(gòu)型包容性的二肽合成酶，且其催化簡(jiǎn)單易操作,原材料成本低,催化效率高,時(shí)間成本低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何開(kāi)發(fā)一種具有底物寬泛性和構(gòu)型包容性的二肽合成酶，且其催化簡(jiǎn)單易操作,原材料成本低,催化效率高,時(shí)間成本低。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種新型二肽合成酶，核苷酸序列如seq?id?no：1所示；氨基酸序列如seq?id?no：2所示。

3、本發(fā)明還提供了一種二肽合成酶的重組方法，包括以下步驟：

4、步驟1、以鏈霉菌streptomyces?albogriseolus?1-36為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并將擴(kuò)增產(chǎn)物的純化，得到基因alb28；

5、步驟2、將步驟1得到的基因alb28，將它連接到高效表達(dá)載體pet-28a(+)的ncoi和xhoi酶切位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取重組質(zhì)粒；

6、步驟3、將步驟2得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，得到高效表達(dá)二肽合成酶的基因工程菌株；

7、步驟4、將步驟3得到的基因工程菌株誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過(guò)純化得到二肽合成酶。

8、進(jìn)一步地，步驟1使用引物1和引物2，引物1的堿基序列如seq?id?no.3所示，引物2的堿基序列如seq?id?no.4所示。

9、進(jìn)一步地，步驟2還包括重組質(zhì)粒的pcr驗(yàn)證，驗(yàn)證使用引物3和引物4，引物3的堿基序列如seq?id?no.5所示，引物4的堿基序列如seq?id?no.6所示。

10、本發(fā)明還提供了一種二肽合成酶在二肽類化合物合成反應(yīng)中的應(yīng)用。

11、進(jìn)一步地，二肽合成酶可以識(shí)別非天然氨基酸來(lái)源的19種不同構(gòu)型的羧基供體和7種氨基供體兩兩組合反應(yīng)。

12、進(jìn)一步地，非天然氨基酸來(lái)源的19種不同構(gòu)型的羧基供體包括l/d-異絲氨酸、β-丙氨酸、l-2,3二氨基丙酸、l/d-3-氨基異丁酸、l/d-3-氨基丁酸、3-氨基-4-羥基丁酸、4-氨基丁酸、2-羥基-4-氨基丁酸、d-2,4-二氨基丁酸、4-氨基-2-甲基丁酸、l/d-4-氨基-3-羥基丁酸、3,4-二氨基丁酸、3-氨基戊酸、4-氨基戊酸和5-氨基戊酸。

13、進(jìn)一步地，7種氨基供體包括l-2b、l-7b、l-12b、l-13b、l-14b、l-15b和l-16b；l-2b如結(jié)構(gòu)式1所示，l-7b如結(jié)構(gòu)式2所示，l-12b、l-13b、l-14b、l-15b和l-16b如結(jié)構(gòu)式3所示；結(jié)構(gòu)式3中n為2、3、4、5、6時(shí)，分別為l-12b、l-13b、l-14b、l-15b、l-16b的結(jié)構(gòu)式，

14、

15、

16、進(jìn)一步地，合成反應(yīng)的最適反應(yīng)ph為9.0，最適反應(yīng)溫度為35℃。

17、本發(fā)明還提供了一種二肽合成酶在以二肽類化合物為前體的化合物合成中的應(yīng)用。

18、進(jìn)一步地，二肽合成酶為二肽類化合物的合成或以二肽類化合物為前體的化合物合成提供更經(jīng)濟(jì)實(shí)用的工具酶。

19、進(jìn)一步地，二肽合成酶,蛋白純化和酶催化過(guò)程簡(jiǎn)單易操作,原材料成本低,催化效率高,時(shí)間成本低。

20、進(jìn)一步地，二肽合成酶,可以在ph9,35℃,5分鐘條件下得到較高的轉(zhuǎn)化效率。

21、在本發(fā)明的較佳實(shí)施方式1中，詳細(xì)說(shuō)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增alb28基因及擴(kuò)增產(chǎn)物的純化過(guò)程；

22、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式2中，詳細(xì)說(shuō)明了表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程；

23、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式3中，詳細(xì)說(shuō)明了重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程；

24、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式4中，詳細(xì)說(shuō)明了重組二肽合成酶的純化過(guò)程；

25、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式5中，詳細(xì)說(shuō)明了重組二肽合成酶底物特異性分析過(guò)程；

26、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式6中，詳細(xì)說(shuō)明了反應(yīng)溫度對(duì)alb28活性的影響；

27、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式7中，詳細(xì)說(shuō)明了反應(yīng)ph對(duì)alb28活性的影響。

28、本發(fā)明有益的技術(shù)效果如下：

29、本發(fā)明通過(guò)pcr技術(shù)成功從鏈霉菌streptomyces?albogriseolus?1-36中克隆出二肽合成酶基因。該基因全長(zhǎng)(從起始密碼子到終止密碼子)為1323bp，g+c含量為64％，編碼440個(gè)氨基酸。

30、通過(guò)pcr技術(shù)擴(kuò)增末端含有載體同源臂的二肽合成酶片段，將它連接到高效表達(dá)載體pet-28a(+)的ncoi和xhoi酶切位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒。將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌株bl21(de3)獲得高效表達(dá)二肽合成酶的基因工程菌株。

31、該工程菌株經(jīng)iptg誘導(dǎo)所生產(chǎn)的二肽合成酶能以l/d-異絲氨酸、β-丙氨酸、l-2,3二氨基丙酸、l/d-3-氨基異丁酸、l/d-3-氨基丁酸、3-氨基-4-羥基丁酸、4-氨基丁酸、2-羥基-4-氨基丁酸、d-2,4-二氨基丁酸、4-氨基-2-甲基丁酸、l/d-4-氨基-3-羥基丁酸、3,4-二氨基丁酸、3-氨基戊酸、4-氨基戊酸和5-氨基戊酸為羧基底物，以l-2b、l-7b、l-12b、l-13b、l-14b、l-15b和l-16b為氨基底物，進(jìn)行兩兩組合反應(yīng)制備得到一系列二肽類化合物。將為二肽類化合物的合成或以二肽類化合物為前體的化合物合成提供更經(jīng)濟(jì)實(shí)用的新工具。

32、該二肽合成酶的最適反應(yīng)ph為9.0，最適反應(yīng)溫度為35℃，適合用于工業(yè)生產(chǎn)中。

33、以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。