本發(fā)明涉及一種生物傳感器，特別涉及一種基于邏輯門的甲流和乙流信號分析系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

1、邏輯門是一種二進制電路，可有效區(qū)分多個信號，使其成為分析復(fù)雜樣品的寶貴工具。在過去的幾年里，通過在分子尺度上實現(xiàn)布爾運算而提供無與倫比的優(yōu)勢的分子邏輯門逐漸取代了傳統(tǒng)的硅基電子計算機。迄今為止，dna生物計算系統(tǒng)已經(jīng)成功制造出來，可以執(zhí)行基本、高級和復(fù)雜的邏輯功能，例如鍵盤鎖、編碼器、解碼器、加法器和減法器。盡管取得了巨大的進步，但它們中的大多數(shù)在實際應(yīng)用中還有待發(fā)展。例如在構(gòu)建邏輯門傳感平臺用于病毒檢測方面，chen等人開發(fā)了四面體的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)及邏輯門用于covid-19或其他冠狀病毒診斷檢測。zuo等人開發(fā)了基于邏輯門和分散到定位催化發(fā)夾組裝的雙片段觸發(fā)dna梯納米結(jié)構(gòu)，用于sars-cov-2和h1n1的熒光檢測。song等人構(gòu)建基于or邏輯門的光電化學(xué)傳感器用于高危人乳頭瘤病毒的邏輯判別。雖然這些設(shè)計成功的用于靶標的檢測，但是它們或需要設(shè)計復(fù)雜的納米結(jié)構(gòu)、或特殊的光電轉(zhuǎn)導(dǎo)、或成本高昂和存在背景泄露。因此建立一種設(shè)計簡單、低成本、特異性識別的病毒邏輯信號分析系統(tǒng)具有重要意義。

2、為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，本發(fā)明涉及一種生物傳感器，特別涉及一種基于crispr/cas12a和邏輯門的甲流和乙流信號分析系統(tǒng)。規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列(crispr)和crispr相關(guān)蛋白(cas)簇對靶向核酸序列具有高度特異性和模塊化，是分子診斷的創(chuàng)新工具。盡管crispr平臺在檢測特異性和靈敏度方面具有強大的生物傳感功能，但crispr/cas系統(tǒng)對報告基因的反式裂解是非特異性的，限制了多重靶標檢測的應(yīng)用。zhang等人篩選出對裂解基團具有不同偏好的cas效應(yīng)子，但是正交cas效應(yīng)子的可用性限制了復(fù)用到四個目標。另外一種可替代方法是將cas反應(yīng)區(qū)室化并運行平行分析。pardis?c.sabeti將液滴流體技術(shù)和crispr技術(shù)結(jié)合用于高通量的核酸檢測。然而，該過程繁瑣，并且需要復(fù)雜的工具來生成、合并和檢測單個液滴。liu采用多個流式腔室來包含靶向特異性crispr/cas12a復(fù)合物。這些方法，需要對不同靶標設(shè)計不同的crrna,或者復(fù)雜的隔離裝置，成本高昂，難以滿足臨床低成本的檢測需求。布爾邏輯可以應(yīng)用于表示為0(no)和1(yes)的任何類型的信息，被廣泛用于實現(xiàn)這種定性分析。在過去的十年中，由于dna具有穩(wěn)定性、可及性和可操作性等優(yōu)勢，大量的研究工作集中在設(shè)計和應(yīng)用能夠?qū)崿F(xiàn)邏輯門控生物醫(yī)學(xué)功能的基于dna邏輯門(dlg)的生物傳感器上。邏輯門控的出現(xiàn)或許可以提高crispr/cas12a對多個靶標分析的能力。

3、本發(fā)明將crispr/cas12a系統(tǒng)與sda等溫擴增和邏輯門耦聯(lián)，實現(xiàn)了甲流和乙流病毒的邏輯識別。sda等溫核酸擴增可提供高效的擴增，無需復(fù)雜的溫度循環(huán)設(shè)備，具有極高的擴增效率。crispr/cas12a具有高度特異性和模塊化，可以增強對靶標的識別。邏輯門可實現(xiàn)對甲流和乙流的邏輯信號分析。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是開發(fā)出一種簡單、通用、特異識別的病毒邏輯信號分析系統(tǒng)。

2、具體技術(shù)方案如下：

3、一種基于crispr/cas12a和邏輯門的甲流和乙流信號分析系統(tǒng)，其制備方法包括以下步驟：

4、(1)甲流和乙流rna序列轉(zhuǎn)化初始階段涉及bstni精確切割rna/dna異源雙鏈體中的dna，以將甲流或乙流rna轉(zhuǎn)化為短dna。將8ul的甲型/乙型流感病毒rna、8ul?10um的甲型/乙型流感病毒dna轉(zhuǎn)化子于37攝氏度孵育10分鐘。接著加入1.5ul?10×的nebuffer3.1、1.7ul?10u/ul的bstni和0.8ul的焦碳酸二乙酯(depc)處理水在55攝氏度反應(yīng)10分鐘，即可得到轉(zhuǎn)化的啟動子a/b。將以上轉(zhuǎn)化的啟動子a/b置于4攝氏度儲存。

5、(2)輸入鏈的制備利用制備的啟動子用于鏈置換等溫擴增(sda)產(chǎn)生下游邏輯門的輸入鏈。將10ul的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、1ul?10um的模板a/b、1ul?10×的bst?dna?polymerase、1ul10×的thermopol、1ul?10×的nt.bstnbi、1ul?10×的nebuffer?r3.1、1ul?10mm的dntp和4ul的純凈水混合，在55攝氏度反應(yīng)30分鐘后在80攝氏度反應(yīng)15min終止反應(yīng)，即可得到輸入鏈inputa/b。

6、(3)邏輯門的制備1.2ul?10um的crrna、1ul?10um的cas和22.8的depc水混合制備400n的crrna-cas復(fù)合物。and邏輯門門控體系中包含2ul?400nm的crrna-cas復(fù)合物、2ul10×的cutsmart緩沖液、1ul?5um的hex報告基因、2ul?10mm的dtt溶液和3ul的depc水。400nm的crrna-cas復(fù)合物、1um的or-pre-exsited-r以體積比2：1孵育10min制備預(yù)復(fù)合物1。400nm的crrna-cas復(fù)合物、1um的or-pre-exsited-l以體積比2：1孵育10min制備預(yù)復(fù)合物2。or邏輯門門控體系中包含1ul預(yù)復(fù)合物1、1ul預(yù)復(fù)合物2、2ul?10×的cutsmart緩沖液、1ul?5um的hex報告基因、2ul?10mm的dtt溶液和3ul的depc水。800nm的crrna-cas復(fù)合物、1um的nor-pre-exsited-l1、1um的nor-pre-exsited-r1以體積比2：1：1孵育10min制備預(yù)復(fù)合物3。800nm的crrna-cas復(fù)合物、1um的nor-pre-exsited-l2、1um的nor-pre-exsited-r2以體積比2：1：1孵育10min制備預(yù)復(fù)合物4。nor邏輯門門控體系中包含1ul預(yù)復(fù)合物3、1ul預(yù)復(fù)合物4、2ul?10×的cutsmart緩沖液、1ul?5um的hex報告基因、2ul?10mm的dtt溶液和3ul的depc水。這樣就建立起基于邏輯門的甲流和乙流信號分析系統(tǒng)。

7、(4)信號輸出將10ul的inputa/b與制備好的10ul的and、or、nor邏輯門門控體系溶液混合，于rotor熒光儀在37攝氏度反應(yīng)1小時，在hex通道測熒光信號，即可對甲流和乙流進行邏輯信號分析。所述步驟(1)中在55攝氏度反應(yīng)10分鐘。

8、所述步驟(2)中在55攝氏度反應(yīng)30分鐘后在80攝氏度反應(yīng)15min終止反應(yīng)。

9、所述步驟(3)中crrna-cas復(fù)合物和or-pre-exsited-r的體積比是2：1并孵育10min制備預(yù)復(fù)合物1。400nm的crrna-cas復(fù)合物、1um的or-pre-exsited-l以體積比2：1并孵育10min制備預(yù)復(fù)合物2。crrna-cas復(fù)合物、nor-pre-exsited-l1、nor-pre-exsited-r1以體積比2：1：1孵育10min制備預(yù)復(fù)合物3。crrna-cas復(fù)合物、nor-pre-exsited-l2、nor-pre-exsited-r2以體積比2：1：1孵育10min制備預(yù)復(fù)合物4。

10、所述步驟(4)中在37攝氏度反應(yīng)1小時。

11、本發(fā)明基于crispr/cas12a和邏輯門建立了甲流和乙流信號分析系統(tǒng)。其檢測原理初始階段涉及bstni精確切割rna/dna異源雙鏈體中的dna，以將甲流或乙流rna轉(zhuǎn)化為短dna用于sda等溫擴增。不同的轉(zhuǎn)換dna，它能與influenzaa和influenza?b的rna序列雜交，從而形成具有bstni核酸內(nèi)切酶識別位點的rna/dna異源雙鏈體。在限制性內(nèi)切酶的作用下，轉(zhuǎn)化子dna會釋放出一個短片段作為sda的啟動子。隨后啟動子與相應(yīng)的sda擴增模板雜交，表現(xiàn)出鏈置換活性的bst?dna聚合酶促進鏈延伸。然后dsdna在這些切口位點被nt.bstnbi切割，釋放出下游的輸入鏈。輸入鏈與設(shè)計好的crispr/cas12a門口反應(yīng)，當甲流和乙流同時存在時，and門可輸出邏輯信號。當甲流和乙流存在其一時，or門可輸出邏輯信號。甲流和乙流都不存在時，nor門可輸出邏輯信號。

12、邏輯門控的成功制備對該邏輯生物傳感器起著至關(guān)重要的作用。我們首先利用合成好的輸入鏈測試and、or、nor門控是否能產(chǎn)生正確的信號。如附圖1所示，為and邏輯門信號輸出時的熒光曲線圖。當同時存在兩個輸入信號inputa和inputb才會產(chǎn)生熒光信號(曲線a)。當只存在inputa時，無熒光信號(曲線b)。當只存在inputb時，無熒光信號(曲線c)。當inputa和inputb都不存在時，無熒光信號(曲線d)。如附圖2所示，為or邏輯門信號輸出時的熒光曲線圖。當同時存在兩個輸入信號inputa和inputb產(chǎn)生熒光信號(曲線a)。當只存在inputa時，產(chǎn)生熒光信號(曲線c)。當只存在inputb時，產(chǎn)生熒光信號(曲線b)。當inputa和inputb都不存在時，無熒光信號(曲線d)。如附圖3所示，為nor邏輯門信號輸出時的熒光曲線圖。當同時存在兩個輸入信號inputa和inputb沒有熒光信號(曲線c)。當只存在inputa時，無熒光信號(曲線b)。當只存在inputb時，無熒光信號(曲線d)。當inputa和inputb都不存在時，產(chǎn)生熒光信號(曲線a)。這些結(jié)果都表明成功構(gòu)建了邏輯門控系統(tǒng)。

13、然后我們證明bstni可以精確切割rna/dna異源雙鏈體中的dna，以將甲流或乙流rna轉(zhuǎn)化為短dna。如附圖4所示，page圖展示了酶切的結(jié)果。泳道1是甲流rna，泳道2是甲流轉(zhuǎn)換子convertora，泳道3是i甲流rna和convertora的復(fù)合物。泳道4是酶切后的條帶，泳道5是其不添加酶的結(jié)果，泳道6是inititor-a對的照物。這些結(jié)果說明甲流rna成功轉(zhuǎn)化出了dna啟動子a。泳道7是乙rna，泳道8是轉(zhuǎn)換子convertor?b，泳道9是乙流rna和convertorb的復(fù)合物，泳道10是酶切后的產(chǎn)物，泳道11是不添加酶的產(chǎn)物，泳道12是inititor-b對的照物。這些結(jié)果說明乙流rna成功轉(zhuǎn)化出了dna啟動子b。

14、接著我們將上述轉(zhuǎn)化的啟動子用于sda擴增產(chǎn)生輸入鏈。如附圖5所示，展示了and和or邏輯門所需輸入鏈產(chǎn)生的結(jié)果。泳道1是inititor-a，泳道2是模板a，泳道3是inititor-a和a模板a的復(fù)合物，泳道4是擴增陽性產(chǎn)生的結(jié)果，泳道5是擴增陰性，泳道6是input1的參照物。這些結(jié)果說明甲流轉(zhuǎn)化出的啟動子成功擴增出了輸入鏈a。泳道7是inititor-b泳道8是模板b，泳道9是inititor-b和模板b的復(fù)合物，泳道10是擴增陽性產(chǎn)生的結(jié)果，泳道11是擴增陰性，泳道12是input2的參照物。這些結(jié)果說明乙流轉(zhuǎn)化出的啟動子成功擴增出了輸入鏈b。如附圖6所示，展示了nor邏輯門所需輸入鏈產(chǎn)生的結(jié)果。泳道1是inititor-a，泳道2是模板a，泳道3是inititor-a和模板a的復(fù)合物，泳道4是擴增陽性的結(jié)果，泳道5是擴增陰性，泳道6是input1參照物。這些結(jié)果說明甲流轉(zhuǎn)化出的啟動子成功擴增出了輸入鏈a。泳道7是inititor-b泳道8是模板b，泳道9是inititor-b和模板b的復(fù)合物，泳道10是擴增陽性產(chǎn)生的結(jié)果，泳道11是擴增陰性，泳道12是input2的參照物。這些結(jié)果說明乙流轉(zhuǎn)化出的啟動子成功擴增出了輸入鏈b。

15、最后是信號的邏輯分析。我們將上述產(chǎn)生的輸入鏈分別加入到邏輯門控體系中驗證最終信號的輸出。如附圖7所示，為and邏輯門信號輸出時的熒光條形圖。當同時存在甲流和乙流時，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、擴增、輸入后產(chǎn)生了信號(條圖c)。當只存在甲流時，無信號(條圖a)。當只存在乙流時，無信號(條圖b)。當不存在甲流和乙流時，無信號(條圖d)。如附圖8所示，為or邏輯門信號輸出時的熒光條形圖。當同時存在甲流和乙流時，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、擴增、輸入后產(chǎn)生了信號(條圖a)。當只存在甲流時，有信號(條圖b)。當只存在乙流時，有信號(條圖c)。當不存在甲流和乙流時，無信號(條圖d)。如附圖9所示，為nor邏輯門信號輸出時的熒光條形圖。當同時存在甲流和乙流時，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、擴增、輸入后無信號(條圖a)。當只存在甲流時，無信號(條圖b)。當只存在乙流時，無信號(條圖c)。當不存在甲流和乙流時，產(chǎn)生信號(條圖d)。上述結(jié)果證明了crispr/cas12a邏輯門控系統(tǒng)分析甲流和乙流的可行性。

16、本發(fā)明將crispr/cas12a系統(tǒng)與sda等溫擴增和邏輯門耦聯(lián)，成功實現(xiàn)了甲流和乙流病毒的邏輯識別。bstni精確切割可以實現(xiàn)rna的轉(zhuǎn)化，拓寬了靶標檢測范圍。sda等溫核酸擴增可提供高效的擴增，無需復(fù)雜的溫度循環(huán)設(shè)備，可實現(xiàn)靶標信號的放大。crispr/cas12a具有高度特異性識別能力，可以增強對靶標的識別，其模塊化特性增加了與其他分子網(wǎng)絡(luò)銜接的能力。邏輯門實現(xiàn)了對甲流和乙流的邏輯信號分析。同時，我們提出的這種檢測策略，只需要改變轉(zhuǎn)換子和擴增的模板，就可以實現(xiàn)其他核酸的檢測。結(jié)果表明，該邏輯門生物傳感器在疾病診斷方面具有潛在的應(yīng)用價值。