本發(fā)明涉及分子生物學，具體為一種大氣環(huán)境微生物基因組dna提取方法。

背景技術：

1、大氣氣溶膠是全球生物地球化學循環(huán)的關鍵載體之一，從生物圈直接排放到大氣中的固體顆粒屬于一次生物源氣溶膠顆粒，也被稱為生物氣溶膠。大氣微生物是生物氣溶膠的重要組分，主要包括細菌和真菌等，大氣微生物不僅可以隨風傳輸，也具有一定的代謝活性，參與生物地球化學循環(huán)過程。大氣環(huán)境中的某些細菌和真菌可作為有效的云凝結核和冰核參與云和降水形成，具有潛在的重要氣候效應；一些致病菌會破壞人體免疫平衡，威脅人體健康。因此，大氣微生物與各種環(huán)境、氣候和健康效應密切相關，是聯系“人與環(huán)境”的重要橋梁。充分認識大氣微生物的物種多樣性、功能活性和遺傳適應性等特征將有利于厘清大氣微生物在地-氣界面過程中的重要作用。

2、在利用分子生物學方法研究大氣微生物組時，提取高濃度高質量的大氣微生物基因組dna是基于高通量測序技術檢測大氣中微生物組成和功能的重要前提。宏基因組學是研究復雜微生物生態(tài)的有力工具，也是闡明大氣微生物群落功能的重要手段。然而，大氣微生物的豐度比海洋、淡水水體、沉積物和土壤等生態(tài)系統(tǒng)低幾個數量級，且收集到的大氣顆粒物通常也僅在幾十到幾百毫克，可用性有限，因此大氣樣品的生物含量整體偏低。另一方面，大氣顆粒物的化學成分復雜，腐殖酸、苯酚、蛋白質等化合物都會降低dna的純度，對下游實驗產生不利影響。因此，獲取高濃度高質量的大氣微生物基因組dna是目前大氣微生物生態(tài)學研究的重點和難點。

3、目前所使用的大氣微生物基因組dna提取方法主要可分為兩大類：第一類是傳統(tǒng)dna提取方法，主要是將大氣顆粒物石英采樣膜直接剪碎至離心管中，隨后使用十六烷基三甲基溴化銨ctab法進行基因組dna的提取，在提取過程中需要加入β-巰基乙醇、酚-氯仿和異丙醇等有毒化學品，且在實驗過程中需要嚴格控制蛋白酶的消解溫度。因此這種提取方法操作十分復雜，實驗時間長，效率低，大量的石英纖維在提取過程中會吸附dna，使得提取效率大幅度下降，獲得的dna濃度低且質量差，不利于開展后續(xù)的分子生物學實驗。第二類是利用商業(yè)化的試劑盒，此類方法雖降低了有毒有害化學品的使用，減少了對實驗人員健康的威脅，但此方法所能處理的石英采樣膜樣品量較少，大多為直徑20～50mm的石英采樣膜。這種僅從小部分樣品中提取的微生物基因組dna并不能有效反映大氣環(huán)境中實際微生物的組成，容易造成部分稀有的、低豐度的微生物物種漏檢；重要的是，這種方法所獲得的大氣微生物基因組dna濃度較低，存在蛋白等雜質的殘留，無法達到宏基因組學建庫測序的標準。此外，也有方法先通過水溶液沖洗大氣顆粒物，并富集到面積小的膜上，再對面積小的膜進行dna的提取，但目前所公布的相關方法整體處理過程十分復雜，實驗時間長，操作步驟過多，樣品處理效率低，樣品損失較大。綜上所述，目前所使用的大氣微生物基因組dna提取方法尚難以方便且有效地獲取足量且純度高的dna，用于支持微生物宏基因組學研究，這也限制了對大氣環(huán)境中微生物功能基因的探索。

技術實現思路

1、針對目前大氣微生物基因組dna提取方法中存在的生物量低、石英采樣膜吸附、操作過程復雜、提取效率差等技術問題，本發(fā)明提供一種大氣環(huán)境微生物基因組dna提取方法，能夠有效富集大氣顆粒物中的微生物成分，去除腐殖酸、苯酚、蛋白質等雜質，提高了采樣膜的利用效率，大幅度提升所提取的dna濃度和質量，滿足大氣環(huán)境微生物宏基因組學研究的實驗要求，推動了對大氣微生物生理生態(tài)功能的研究。

2、本發(fā)明的技術方案如下：

3、一種大氣環(huán)境微生物基因組dna提取方法；包括如下步驟：

4、(1)利用石英濾膜進行大氣顆粒物的采集，而后將石英濾膜貼壁放置于無菌無酶離心管中，加入緩沖液先進行冰浴超聲，然后通過離心充分洗脫采集到的顆粒物，得到洗脫液；

5、(2)將洗脫液轉移至新的離心管中保存，向裝有石英濾膜的離心管中再次加入緩沖液，冰浴超聲，進行大氣顆粒物的二次洗脫，得到二次洗脫液；

6、(3)將兩次得到的洗脫液過濾到孔徑為0.22μm聚醚砜濾膜上，在過濾過程中將洗脫后的石英濾膜放置于注射器中，用針管活塞充分擠壓石英采樣膜，至無洗脫液從注射器中滴落，將這部分洗脫液也過濾至聚醚砜濾膜上；

7、(4)將已經富集了大氣顆粒物的聚醚砜濾膜剪碎后轉移至裂解管中，加入裂解液，以2500–2800轉/分的轉速高速震蕩裂解后進行加熱，在洗脫dna時通過加熱吸附柱進行熱脫附，提取濾膜上的大氣微生物基因組dna，通過瓊脂糖凝膠電泳直觀檢測dna，通過超微量分光光度計檢測dna濃度和純度。

8、所述的步驟(1)中：采樣方法是，利用石英纖維濾膜通過大流量空氣采樣器以1.00–1.15m3/min的流速采集總懸浮顆粒物48–72小時，或在石英采樣膜上觀察到明顯的灰色或棕色的大氣顆粒物沉積。

9、所述的步驟(1)中：洗脫方法是，使用無菌剪刀剪下至少八分之一且不超過四分之一的石英采樣膜，貼壁放置在無菌無酶的離心管中，加入在0–4℃提前預冷且無菌的0.01–0.02mol/l?ph為7.2–7.4的磷酸鹽緩沖液，在150–200w的功率下冰浴超聲5–10min，然后在0–4℃條件下以200–220×g進行低速離心2–3小時。

10、所述的步驟(2)中：離心洗脫后，將洗脫液轉移到無菌無酶的離心管中，向裝有采樣膜的離心管內再次加入緩沖液，在150–200w的功率下冰浴超聲5–10min，進行二次洗脫。

11、所述的步驟(3)中：使用孔徑為0.22μm，直徑為47–50mm的聚醚砜濾膜對兩次洗脫所獲得的大氣顆粒物懸濁液進行負壓抽濾，在過濾過程中，將參與洗脫的采樣膜轉移至無菌注射器中，使用針管活塞充分擠壓吸收了洗脫液的石英膜，至無液體從注射器中滴落，將這部分洗脫液也過濾至濾膜上。

12、所述的步驟(4)中：將富集獲得的聚醚砜濾膜在超凈環(huán)境下用已經滅菌的剪刀剪碎為0.1–0.25cm2的碎片，隨后轉移至?pro?kit試劑盒所提供的裂解管中，在2500–2800轉/分的轉速高速震蕩裂解后需在60–65℃水浴中加熱15–20min，以促進細胞的裂解，使用10mm三羥甲基氨基甲烷溶液進行dna洗脫時，需先在60–65℃水浴中加熱10–15min，催進dna脫附，其他實驗流程參照試劑盒中dna提取步驟進行，將提取獲得的基因組dna進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

13、具體說明如下：

14、一種大氣環(huán)境微生物基因組dna提取方法，包括：

15、(1)利用石英濾膜進行大氣顆粒物的采集，而后將石英濾膜貼壁放置于無菌無酶離心管中，

16、加入緩沖液先進行冰浴超聲，然后通過離心充分洗脫采集到的顆粒物，得到洗脫液；

17、(2)將洗脫液轉移至新的離心管中保存，向裝有石英濾膜的離心管中再次加入緩沖液，冰浴超聲，進行大氣顆粒物的二次洗脫，得到二次洗脫液；

18、(3)將兩次得到的洗脫液過濾到孔徑為0.22μm聚醚砜濾膜上，在過濾過程中將洗脫后的石英濾膜放置于注射器中，用針管活塞充分擠壓石英采樣膜，至無洗脫液從注射器中滴落，將這部分洗脫液也過濾至聚醚砜濾膜上；

19、(4)將已經富集了大氣顆粒物的聚醚砜濾膜剪碎后轉移至裂解管中，加入裂解液，以2500

20、–2800轉/分的轉速高速震蕩裂解后進行加熱，在洗脫dna時通過加熱吸附柱進行熱脫附，提取濾膜上的大氣微生物基因組dna，通過瓊脂糖凝膠電泳直觀檢測dna，

21、通過超微量分光光度計檢測dna濃度和純度。

22、優(yōu)選地，所述步驟(1)具體為：利用石英纖維濾膜(20.3×25.4cm)通過大流量空氣采樣器以1.00–1.15m3/min的流速采集總懸浮顆粒物(tsp)48–72小時，或在石英采樣膜上觀察到明顯的灰色或棕色的大氣顆粒物沉積，隨后使用無菌的剪刀剪下至少八分之一(9×5.5cm)且不超過四分之一(9×11cm)的石英采樣膜，用鑷子夾住采樣膜的邊緣，貼壁放置在無菌無酶的離心管中，確保采樣膜在離心管中不產生交疊，加入在0–4℃提前預冷且無菌的0.01–0.02mol/l?ph為7.2–7.4的磷酸鹽(pbs)緩沖液，在150–200w的功率下冰浴超聲5–10min，使顆粒物脫離采樣膜但細胞不破裂，然后在0–4℃條件下以200–220×g進行低速離心2–3小時。

23、優(yōu)選地，所述步驟(2)具體為：離心洗脫結束后，大氣顆粒物主要集中在離心管內采樣膜兩邊相接處的底部，隨后沿采樣膜相接處的方向將洗脫液轉移到無菌無酶的離心管中，向裝有采樣膜的離心管內再次加入在0–4℃提前預冷且無菌的0.01–0.02mol/l?ph為7.2–7.4的磷酸鹽(pbs)緩沖液，在150–200w的功率下冰浴超聲5–10min，通過二次洗脫充分收集采樣膜所捕集到的細胞。

24、優(yōu)選地，所述步驟(3)具體為：使用孔徑為0.22μm，直徑為47–50mm的聚醚砜(pes)濾膜對兩次洗脫所獲得的大氣顆粒物懸濁液進行負壓抽濾，以達到對顆粒物尤其是大氣微生物的富集，在過濾過程中，將參與洗脫的采樣膜轉移至無菌注射器中，使用針管活塞充分擠壓吸收了洗脫液的石英膜，至無液體從注射器中滴落，將這部分洗脫液也過濾至濾膜上，此濾膜用于提取基因組dna。

25、優(yōu)選地，所述步驟(4)具體為：將富集獲得的聚醚砜(pes)濾膜在超凈環(huán)境下用滅菌的剪刀剪碎為0.1–0.25cm2的碎片，隨后轉移至?pro?kit試劑盒(47014，qiagen，germany)所提供的裂解管中，在2500–2800轉/分的轉速高速震蕩裂解后需在60–65℃水浴中加熱15–20min，以促進細胞的裂解，使用10mm三羥甲基氨基甲烷(tris)溶液進行dna洗脫時，需先在60–65℃水浴中加熱10–15min，催進dna脫附，其他實驗流程參照試劑盒中dna提取步驟進行，將提取獲得的基因組dna進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像儀中可以清晰地看到dna片段的分布情況，說明本方法獲得的大氣微生物基因組dna片段的完整性較好，通過超微量分光光度計檢測dna濃度和純度，dna濃度不小于2ng/μl且總量不小于0.30μg是宏基因組建庫的最低標準，純度指標od260/od280在1.8–2.0之間，說明dna中無蛋白質或者酚類物質的殘留，od260/od230不小于2，說明樣品中沒有腐殖酸、糖類和胍鹽等的污染，通過本方法所得到的大氣微生物基因組dna均符合建庫標準并進行了宏基因組測序。

26、與現有的大氣微生物基因組dna提取技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

27、1.本發(fā)明提供的大氣環(huán)境微生物基因組dna提取方法，可以有效的減少β-巰基乙醇、酚-氯仿-異戊醇和異丙醇等有毒化學品的使用，減少了對實驗人員健康的威脅，在大氣顆粒物的洗脫過程中簡化了部分處理過程，降低了引入污染的機會，也使實驗時間大幅縮短，前處理和提取效率得到提高，從大部分樣品中提取的大氣微生物基因組dna更有效地反映了環(huán)境樣品的實際微生物組成，由此獲得的高濃度高質量的dna將可以達到宏基因組學建庫測序的標準，推動對大氣微生物潛在功能和活性的研究。

28、2.本發(fā)明提供的大氣環(huán)境微生物基因組dna提取方法，可以適用于不同環(huán)境采集的大氣氣溶膠采樣膜，通過預冷緩沖液、低功率冰浴超聲、低溫離心、二次洗脫和抽濾富集等步驟，在洗脫過程中最大限度的保護了大氣微生物細胞的完整性，有效地富集了所采集的大氣顆粒物，同時通過洗脫過程也有效的去除了樣品中的腐殖酸、苯酚和蛋白質等雜質的干擾，通過優(yōu)化后的提取步驟所得到的總dna可以直接進行下游的分子生物學實驗，如pcr擴增、qpcr熒光定量、擴增子測序和宏基因組測序等。

29、3.利用本發(fā)明提供的大氣環(huán)境微生物基因組dna提取方法，可實現大氣氣溶膠中細菌、古菌和真菌等微生物dna的高效提取，同時也包含了大氣環(huán)境中的病毒dna，所獲得的大氣環(huán)境微生物dna濃度和質量都滿足大氣微生物宏基因組學研究的實驗要求，獲得了完整性較好的基因組dna，其片段長度在1000–15000bp之間，純度指標1.8≤od260/od280≤2.0，od260/od230≥2.0，所得的dna可以直接進行宏基因組實驗的dna片段化(200–500bp)、建庫、質控和上機測序等操作，基本可以達到一次建庫成功，所獲得的宏基因組測序結果的測序深度達標，序列拼接率高，組裝片段完整，符合大氣微生物宏基因組研究的數據要求。