本發(fā)明屬于腫瘤類器官培養(yǎng)，具體涉及一種髓母細(xì)胞瘤類器官及其培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、髓母細(xì)胞瘤是兒童惡行程度最高的常發(fā)腦腫瘤疾病之一，具有高度的異質(zhì)性。髓母細(xì)胞瘤類器官是一種用于研究髓母細(xì)胞瘤的體外三維細(xì)胞培養(yǎng)模型，由患者腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的三維組織，它概括了母體腫瘤的特征。合格的腫瘤類器官模型可以保持細(xì)胞多樣性，維持原生細(xì)胞間的相互作用，概括定義組織學(xué)特征，并維持母體腫瘤的轉(zhuǎn)錄組和突變譜，是研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、藥物反應(yīng)和個(gè)性化治療的重要工具。

2、目前已有從手術(shù)切除的患者腫瘤組織中使用化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基產(chǎn)生膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官(gbos)的案例，其通過(guò)保持細(xì)胞間相互作用和極小的克隆片段，gbos維持了親本腫瘤的細(xì)胞異質(zhì)性。該培養(yǎng)基是由dmem:f12、neurobasal、glutamax(100x)、neaas(100x)、penstrep(100x)、n2(100x)、b27?w/o?vitamina(50x)、insulin(2.5mg/ml)和2-me(1：1000)組成，配方思路來(lái)源于類腦器官皮層方向發(fā)育培養(yǎng)基改良，詳見(jiàn)fadi?jacob等人發(fā)表的《generation?and?biobanking?of?patient-derived?glioblastoma?organoidsand?their?application?incar?t?cell?testing》和《a?patient-derived?glioblastomaorganoid?model?and?biobank?recapitulates?inter-and?intra-tumoralheterogeneity》。然而現(xiàn)有方法膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官凍存后復(fù)蘇不穩(wěn)定，該方法僅適用于膠母類器官。髓母細(xì)胞瘤多發(fā)于小腦，腫瘤稀疏，原代細(xì)胞多為懸浮生長(zhǎng)，目前類器官的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)基配方不適用于與腫瘤組織高度相似的髓母細(xì)胞瘤類器官模型的建立，培養(yǎng)方式和培養(yǎng)基配方均有待改進(jìn)。

3、現(xiàn)有技術(shù)中，cn116769715a專利公開(kāi)了一種用于髓母細(xì)胞瘤類器官及3d微球懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基由以下組分構(gòu)成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、不含維生素a的b27、n2、n-acetylcysteine、fgfb、noggin、r-spondin、wnt3a、chir99021、laminin、sialicacid、neaa、青霉素鏈霉素混合液和primocin；基礎(chǔ)培養(yǎng)基是由advanced?dmem/f12和neuralbasal培養(yǎng)基按體積比1:10-150:1混合組成。髓母細(xì)胞瘤類器官及3d微球的懸浮培養(yǎng)方法包括如下步驟：(1)分離獲取髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞；該髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞是由髓母細(xì)胞瘤的手術(shù)切除標(biāo)本或活檢組織經(jīng)預(yù)處理獲得；(2)使用前述培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板內(nèi)，于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至獲得髓母細(xì)胞瘤類器官或髓母細(xì)胞瘤3d微球。該專利采用胰蛋白酶、膠原蛋白酶、dna酶的混合酶溶液將組織消化后重新組合后生成的髓母腫瘤球類器官。這種類器官的建立方法將腫瘤組織消化為單細(xì)胞，后重新隨機(jī)組合而形成了包含多個(gè)細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)3d球。此類器官破壞了髓母細(xì)胞瘤獨(dú)特的腫瘤結(jié)構(gòu)(如某髓母細(xì)胞瘤亞型中所具有的假菊形團(tuán)結(jié)構(gòu))，也破壞了細(xì)胞間的相互作用，重新生成的髓母細(xì)胞瘤改變了腫瘤內(nèi)環(huán)境，無(wú)血管結(jié)構(gòu)，不能很好模擬體內(nèi)髓母細(xì)胞瘤的形態(tài)特征。

4、髓母細(xì)胞瘤表現(xiàn)出廣泛的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，然而大多數(shù)體外模型不能保留親本腫瘤的細(xì)胞和突變多樣性，并且通常需要較長(zhǎng)的生成時(shí)間和帶有可變率。這使得目前兒童惡性腦腫瘤類器官模型仍處于空白狀態(tài)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于培養(yǎng)髓母細(xì)胞瘤類器官的培養(yǎng)基，采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)髓母細(xì)胞瘤類器官，可更好的保留親本腫瘤的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、用于培養(yǎng)髓母細(xì)胞瘤類器官的培養(yǎng)基，待培養(yǎng)的類器官為髓母細(xì)胞瘤類器官；所述培養(yǎng)基包括如下組分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、終濃度為1％-10％的kosr、終濃度為1x的glutamax、終濃度為1x的a-a、終濃度為1％-3％的cdlc、終濃度為1x的n2和終濃度為1x的b27。

4、作為優(yōu)選，所述kosr的終濃度為2％；所述cdlc的終濃度為1％。

5、進(jìn)一步，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括dmem:f12和neurobasal；所述dmem:f12和neurobasal的體積比為1-5：1-5。

6、作為優(yōu)選，所述dmem:f12和neurobasal的體積比為1：1。

7、進(jìn)一步，所述培養(yǎng)基中還包含終濃度為3～8μg/ml的heparin、終濃度為0.3～0.8ng/ml的t3和終濃度為10～20ng/ml的bdnf。

8、作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基中，heparin的終濃度為5μg/ml、t3的終濃度為0.5ng/ml，bdnf的終濃度為14ng/ml。

9、作為最優(yōu)選，所述培養(yǎng)基由如下組分組成：dmem:f12、neurobasal、終濃度為2％的kosr、終濃度為1x的glutamax、終濃度為1x的a-a、終濃度為1％的cdlc、終濃度為1x的n2、終濃度為1x的b27、終濃度為5μg/ml的heparin、終濃度為0.5ng/ml的t3和終濃度為14ng/ml的bdnf；所述dmem:f12和neurobasal的體積比為1:1。

10、本發(fā)明的目的之二在于提供一種無(wú)需酶消化培養(yǎng)髓母細(xì)胞瘤類器官的方法。

11、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

12、無(wú)需酶消化培養(yǎng)髓母細(xì)胞瘤類器官的方法，包括如下步驟：

13、(1)取髓母細(xì)胞瘤腫瘤組織，直接切塊后進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，得到小腫瘤塊；所述髓母細(xì)胞瘤腫瘤組織無(wú)需進(jìn)行酶消化處理；

14、(2)采用前述培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟(1)所得小腫瘤塊，生成髓母細(xì)胞瘤類器官；

15、(3)步驟(2)所得髓母細(xì)胞瘤類器官采用前述培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到髓母細(xì)胞瘤類器官。

16、進(jìn)一步，步驟(1)中，所述髓母細(xì)胞瘤腫瘤組織優(yōu)選外科手術(shù)切下的髓母細(xì)胞瘤腫瘤組織。

17、進(jìn)一步，步驟(1)中，所述髓母細(xì)胞瘤腫瘤組織先采用冰的pbs加入三抗清洗，然后再進(jìn)行切塊。

18、進(jìn)一步，步驟(1)中，所述紅細(xì)胞裂解包括：加入紅細(xì)胞裂解緩沖液，在轉(zhuǎn)速為5轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上，孵育5-15分鐘。

19、進(jìn)一步，步驟(2)和步驟(3)中，培養(yǎng)條件為：在37±5℃，5±2％co2，90±5％相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中的水平搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，第一天設(shè)置轉(zhuǎn)速為80±5轉(zhuǎn)/分鐘，后期設(shè)置轉(zhuǎn)速為100±5轉(zhuǎn)/分鐘。

20、進(jìn)一步，步驟(2)和步驟(3)中，10-20片腫瘤片加入4ml髓母細(xì)胞瘤類器官培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

21、作為優(yōu)選，所述方法具體包括如下步驟：

22、①組織處理：取外科手術(shù)切下的髓母細(xì)胞瘤腫瘤組織，采用冰的pbs加入三抗進(jìn)行清洗；在冰上放置的玻璃皿內(nèi)將清洗后的腫瘤組織切成0.5-1毫米的小塊，常溫pbs清洗，加入紅細(xì)胞裂解緩沖液，在轉(zhuǎn)速為5轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上，孵育5-15分鐘；采用室溫dmem:f12清洗后，得到小腫瘤塊。

23、②組織塊培養(yǎng)：步驟①所得小腫瘤塊采用前述培養(yǎng)基，在37℃，5％co2，90％相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中的水平搖床上進(jìn)行培養(yǎng)；第一天設(shè)置轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分鐘，后期設(shè)置轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘；每3天更換培養(yǎng)基，得到類器官。

24、③髓母細(xì)胞瘤類器官傳代：在髓母細(xì)胞瘤類器官的直徑達(dá)到約1-2毫米時(shí)進(jìn)行傳代。常溫下，在超凈臺(tái)中玻璃皿內(nèi)，使用解剖顯微鏡進(jìn)行傳代。用解剖剪刀將每個(gè)類器官中心對(duì)切等分成四塊，采用前述用于培養(yǎng)髓母細(xì)胞瘤類器官的培養(yǎng)基，在37℃，5％co2，90％相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中的水平搖床上進(jìn)行培養(yǎng)；第一天設(shè)置轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分鐘，后期設(shè)置轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘。類器官傳代1周后，待類器官周邊圓潤(rùn)后進(jìn)行凍存即可。

25、進(jìn)一步，所述髓母細(xì)胞瘤類器官采用如下方法進(jìn)行凍存：將所述髓母細(xì)胞瘤類器官采用含8-15μmy-27632的髓母細(xì)胞瘤類器官培養(yǎng)基進(jìn)行孵育，然后采用凍存液進(jìn)行凍存；所述凍存液由髓母細(xì)胞瘤類器官培養(yǎng)基、y-27632和dmso組成；所述凍存液中y-27632的含量為8-15μm，所述dmso的含量為10％。

26、作為優(yōu)選，髓母細(xì)胞瘤類器官采用含10μmy-27632的髓母細(xì)胞瘤類器官培養(yǎng)基進(jìn)行孵育，然后采用凍存液進(jìn)行凍存；所述凍存液由髓母細(xì)胞瘤類器官培養(yǎng)基、y-27632和dmso組成；所述凍存液中y-27632的含量為10μm，所述dmso的含量為10％。

27、作為優(yōu)選，凍存方法具體包括如下步驟：

28、類器官更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含10μm?y-27632；以100轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速孵育腫瘤片3小時(shí)；37℃，5％co2，90％相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；吸棄含10μmy-27632的類器官培養(yǎng)基，加入常溫類器官凍存液，室溫5轉(zhuǎn)/分鐘孵育5分鐘；吸棄凍存液，加入在4℃預(yù)冷的凍存液重懸類器官；轉(zhuǎn)移到凍存管中，于-80℃冰箱中梯度冷凍24小時(shí)，轉(zhuǎn)移到液氮長(zhǎng)期保存。

29、進(jìn)一步，所述髓母細(xì)胞瘤類器官采用如下方法進(jìn)行復(fù)蘇：將凍存的髓母細(xì)胞瘤類器官解凍后，加入含8-15μmy-27632的髓母細(xì)胞瘤類器官培養(yǎng)基和前述凍存液過(guò)夜靜置培養(yǎng)；第二天采用不含8-15μmy-27632的培養(yǎng)基在水平搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。

30、作為優(yōu)選，將凍存的髓母細(xì)胞瘤類器官解凍后，加入含10μmy-27632的髓母細(xì)胞瘤類器官培養(yǎng)基和前述凍存液過(guò)夜靜置培養(yǎng)；第二天采用不含10μmy-27632的培養(yǎng)基在水平搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。

31、作為優(yōu)選，復(fù)蘇方法具體包括如下步驟：

32、將類器官?gòu)囊旱腥〕?，解凍后加入?0μmy-27632的髓母細(xì)胞瘤類器官培養(yǎng)基，邊加入凍存液邊晃動(dòng)，緩慢稀釋含dmso的凍存液；吸棄上清，加入含10μm?y-27632的髓母細(xì)胞瘤類器官培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板上，在37℃，5％co2，90％相對(duì)濕度的無(wú)菌培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過(guò)夜；第二天，將培養(yǎng)基替換為不含10μmy-27632的髓母細(xì)胞瘤類器官培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移100轉(zhuǎn)/分鐘水平搖床上，在37℃，5％co2，90％相對(duì)濕度的無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即可。

33、本發(fā)明的目的之三在于提供一種采用前述方法培養(yǎng)得到的髓母細(xì)胞瘤類器官。

34、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

35、采用前述方法培養(yǎng)得到的髓母細(xì)胞瘤類器官。

36、進(jìn)一步，所述髓母細(xì)胞瘤類器官包含親本腫瘤的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。

37、進(jìn)一步，所述髓母細(xì)胞瘤類器官保留了親本腫瘤所具有的神經(jīng)母細(xì)胞菊形團(tuán)或假菊形團(tuán)結(jié)構(gòu)；和/或保留了親本腫瘤的細(xì)胞類型：β3-tubulin(神經(jīng)元)、gfap(星形膠質(zhì)細(xì)胞)、iba1(小膠質(zhì)細(xì)胞)、olig2(少突膠質(zhì)細(xì)胞)和cd31(內(nèi)皮細(xì)胞-代表脈管系統(tǒng))，并保持其分布特點(diǎn)不變。

38、本發(fā)明的目的之四在于提供一種前述髓母細(xì)胞瘤類器官在制備用于篩選抗髓母細(xì)胞瘤的藥物和/或構(gòu)建髓母細(xì)胞瘤動(dòng)物模型中的應(yīng)用。

39、本發(fā)明的有益效果在于：

40、1.本發(fā)明采用類腦器官小腦方向發(fā)育穩(wěn)定生長(zhǎng)期培養(yǎng)基配方，結(jié)合髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞類型所需營(yíng)養(yǎng)特性，改良成一款適合髓母細(xì)胞瘤類器官生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。本發(fā)明通過(guò)大量的研究后發(fā)現(xiàn)，髓母細(xì)胞瘤類器官不需要血清和細(xì)胞外基質(zhì)(如matrigel)等不明確的添加物即可存活并形成優(yōu)質(zhì)類器官；該培養(yǎng)基成分明確，不含血清，bfgf和matrigel基質(zhì)膠等含有未知成分可能引起細(xì)胞分化的成分。該培養(yǎng)基包含各種有益于髓母細(xì)胞瘤組織內(nèi)各類細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分，經(jīng)過(guò)多次調(diào)整配方和比例，達(dá)到一種最優(yōu)的配比。

41、2.本發(fā)明使用化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，直接采用手術(shù)切除的患者腫瘤組織即可培養(yǎng)得到腦腫瘤類器官，而不需要分解細(xì)胞。

42、3.目前已有的髓母細(xì)胞瘤類器官培養(yǎng)方式是采用胰蛋白酶、膠原蛋白酶、dna酶的混合酶溶液將組織消化后重新組合后生成的髓母腫瘤球類器官。本發(fā)明的類器官培養(yǎng)方式不經(jīng)過(guò)酶消化，在不破壞原始腫瘤的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞相互作用的情況下生成的于親本腫瘤高度一致的類器官，此類器官可在體外模擬腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)和發(fā)展，可用于個(gè)性化藥篩，且可以和腫瘤組織塊一樣進(jìn)行病理切片和病理染色，是一種高度擬合體內(nèi)腫瘤的類器官模型。

43、4.采用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的類器官，高度保留了親本腫瘤的組織結(jié)構(gòu)，如某些病例可見(jiàn)神經(jīng)母細(xì)胞菊形團(tuán)或假菊形團(tuán)結(jié)構(gòu)；同時(shí)還保留了親本腫瘤的增殖特性(ki67)和細(xì)胞類型，包括神經(jīng)細(xì)胞(β3-tubulin)，星形膠質(zhì)細(xì)胞(gfap)，小膠質(zhì)細(xì)胞(iba1)，少突膠質(zhì)細(xì)胞(olig2)和內(nèi)皮細(xì)胞(cd31)等。本發(fā)明對(duì)髓母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展、藥物反應(yīng)以及個(gè)性化治療的研究提供了支持。