本發(fā)明屬于抗體領(lǐng)域，特別涉及一種靶向pd-l1的抗體與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、程序性細(xì)胞死亡配體1(pd-l1)是一種跨膜蛋白，在腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)，能夠與t細(xì)胞上的程序性細(xì)胞死亡受體1(pd-1)結(jié)合，從而抑制t細(xì)胞的活化，進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。這種相互作用最終會(huì)導(dǎo)致腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，并對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生不良影響。因此，抗pd-l1抗體也是一種抗腫瘤藥物。

2、盡管抗pd-l1抗體在臨床試驗(yàn)中取得了相當(dāng)大的成功，但對(duì)實(shí)體癌的反應(yīng)率僅為20-30％，總體反應(yīng)率相對(duì)較低，部分原因可能是它們?cè)趯?shí)體瘤中的定位和滲透性差。由于單克隆抗體是大分子，因此它們?cè)谀[瘤血管中的分布可能較差，有限的滲透性導(dǎo)致分布不均勻從而影響治療效果。采用小分子抗體形式可能更適合上述情況的腫瘤治療。fab抗體、單鏈抗體(scfv)和雙鏈抗體(diabody)均為小分子抗體，制備方法比其他基因工程抗體簡(jiǎn)單，且免疫原性弱。由于分子量小(25-50kd)，相較于單克隆抗體(150kd)更容易穿過(guò)血管壁進(jìn)入組織發(fā)揮藥效，因此更適用于腫瘤的治療。二硫鍵穩(wěn)定的diabody

3、(disulfide-stabilized?diabody，ds-diabody)是首先在單鏈抗體的基礎(chǔ)上，通過(guò)縮短連接肽，單鏈之間輕鏈重鏈可變區(qū)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合形成diabody，然后在vh44和vl100間引入二硫鍵而形成的穩(wěn)定性增強(qiáng)的抗體，在作為抗腫瘤藥物方面具有更大的潛力。

4、bfgf(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，basic?fibroblast?growth?factor)最初是從大腦和垂體中分離出來(lái)的一種含155個(gè)氨基酸的多肽，作為成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)因子。在腫瘤微環(huán)境中，bfgf與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)的作用類似且兩者起協(xié)同作用，不僅能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及血管生成，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。

5、近年來(lái)，腫瘤免疫治療領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展，提升了患者的生存率。然而，由于腫瘤疾病發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，單純針對(duì)單一靶點(diǎn)的免疫治療往往無(wú)法有效清除靶細(xì)胞，導(dǎo)致部分患者對(duì)治療反應(yīng)不佳或產(chǎn)生耐藥。為了解決這一問(wèn)題，雙特異性抗體(雙特異性antibody，bsab)的研發(fā)被推進(jìn)。bsab通過(guò)細(xì)胞融合、重組dna技術(shù)和蛋白質(zhì)工程等手段制備，具備獨(dú)特的雙重結(jié)合能力，能夠同時(shí)或依次與兩種不同抗原或同一抗原的不同表位特異性結(jié)合。

6、越來(lái)越多的研究表明，抗血管生成療法與免疫檢查點(diǎn)阻斷相結(jié)合可以顯著提高對(duì)各種癌癥的抑制能力。pd-1阻斷可以使腫瘤對(duì)抗血管生成治療敏感，并延長(zhǎng)其在轉(zhuǎn)移性乳腺癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和黑色素瘤模型中的療效?？寡苌芍委熆梢愿纳泼庖邫z查點(diǎn)抑制劑的治療，因?yàn)槟[瘤內(nèi)高內(nèi)皮微靜脈的形成促進(jìn)了免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療，發(fā)揮細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctl)浸潤(rùn)、激活和腫瘤清除等作用。因此，抗血管生成藥物與免疫治療之間存在雙向聯(lián)系和協(xié)同作用，開(kāi)發(fā)能夠同時(shí)抑制血管生成和阻斷免疫檢查點(diǎn)的新治療藥物，是更合理、更有效的癌癥治療方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種靶向pd-l1的抗體。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供上述靶向pd-l1的抗體的應(yīng)用。

3、本發(fā)明的再一目的在于提供一種靶向pd-l1和bfgf的雙特異性雙鏈抗體，其含有上述靶向pd-l1的抗體。

4、本發(fā)明的又一目的在于提供上述pd-l1和bfgf的雙特異性雙鏈抗體的制備方法與應(yīng)用。

5、本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

6、一種靶向pd-l1的抗體，包括輕鏈和重鏈；其中，

7、輕鏈上的3個(gè)cdr的氨基酸序列如下：cdr1為slrsyy，cdr2為gkn，cdr3為nsrdavldwv；

8、重鏈上的3個(gè)cdr的氨基酸序列如下：cdr1為ggsissyy，cdr2為ikqdestk，cdr3為arvwwpgraalsdy。

9、所述的重鏈的氨基酸序列優(yōu)選如seq?id?no.1所示。

10、所述的重鏈的編碼核酸的序列優(yōu)選如seq?id?no.2所示。

11、所述的輕鏈的氨基酸序列優(yōu)選如seq?id?no.3所示。

12、所述的輕鏈的編碼核酸的序列優(yōu)選如seq?id?no.4所示。

13、上述靶向pd-l1的抗體為二硫鍵穩(wěn)定的抗pd-l1人源性雙鏈抗體，其氨基酸序列優(yōu)選如seq?id?no.5所示。

14、一種核酸分子，編碼上述靶向pd-l1的抗體；其核酸序列優(yōu)選如seq?id?no.6所示。

15、上述靶向pd-l1的抗體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

16、所述的腫瘤優(yōu)選為肝癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤等腫瘤。

17、一種靶向pd-l1和bfgf的雙特異性雙鏈抗體，是靶向pd-l1的抗體和靶向bfgf的抗體通過(guò)連接肽連接起來(lái)；含有靶向pd-l1的抗體的6個(gè)cdr和靶向bfgf的抗體的6個(gè)cdr；其中，

18、靶向pd-l1的抗體的6個(gè)cdr的氨基酸序列如下所示：輕鏈的cdr1為slrsyy，輕鏈的cdr2為gkn，輕鏈的cdr3為nsrdavldwv，重鏈的cdr1為ggsissyy，重鏈的cdr2為ikqdestk，重鏈的cdr3為arvwwpgraalsdy；

19、靶向bfgf的抗體的6個(gè)cdr的氨基酸序列如下所示：輕鏈的cdr1為ssdvggyny，輕鏈的cdr2為dvs，輕鏈的cdr3為ssytssstvv，重鏈的cdr1為gftfssye，重鏈的cdr2為isssgsti，重鏈的cdr3為areltgdwgafdiw。

20、所述的靶向pd-l1和bfgf的雙特異性雙鏈抗體的氨基酸序列優(yōu)選如seq?id?no.8所示。

21、一種產(chǎn)品，選自以下任意一種：

22、1)一種核酸分子，編碼上述靶向pd-l1和bfgf的雙特異性雙鏈抗體；其核苷酸序列優(yōu)選如seq?id?no.9所示；

23、2)一種重組表達(dá)載體，含有1)所述的核酸分子；

24、3)一種重組表達(dá)細(xì)胞，含有1)所述的核酸分子或2)所述的重組表達(dá)載體。

25、所述的重組表達(dá)載體的載體框架包括原核表達(dá)質(zhì)粒和真核表達(dá)質(zhì)粒；優(yōu)選為真核表達(dá)質(zhì)粒；更優(yōu)選為酵母表達(dá)質(zhì)粒；最優(yōu)選為ppiczα系列質(zhì)粒；進(jìn)一步為ppiczαa質(zhì)粒。

26、所述的重組表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟：將上述核酸分子克隆入載體框架中，得到重組表達(dá)載體。

27、所述的重組表達(dá)細(xì)胞的出發(fā)細(xì)胞包括原核表達(dá)細(xì)胞和真核表達(dá)細(xì)胞；優(yōu)選為真核表達(dá)細(xì)胞；更優(yōu)選為酵母表達(dá)細(xì)胞；最優(yōu)選為畢氏酵母表達(dá)細(xì)胞；進(jìn)一步為gs115。

28、上述重組表達(dá)細(xì)胞優(yōu)選通過(guò)如下步驟制備得到：將上述核酸分子或上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入出發(fā)細(xì)胞，得到重組表達(dá)細(xì)胞。

29、上述靶向pd-l1和bfgf的雙特異性雙鏈抗體的制備方法，可通過(guò)化學(xué)合成方法制備或通過(guò)基因工程方法制備；優(yōu)選為通過(guò)基因工程方法制備；更優(yōu)選包括如下步驟：將重組表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，純化，得到靶向pd-l1和bfgf的雙特異性雙鏈抗體。

30、上述靶向pd-l1和bfgf的雙特異性雙鏈抗體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

31、所述的腫瘤優(yōu)選為肝癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤等腫瘤。

32、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

33、(1)本發(fā)明篩選到一種親和力高的靶向pd-l1的抗體。

34、(2)本發(fā)明將靶向pd-l1的抗體和靶向bfgf的抗體連接，得到雙靶向pd-l1和bfgf的雙特異性雙鏈抗體。該抗體在體外具有特異性結(jié)合pd-l1和bfgf的能力，能靶向pd-l1從而阻斷pd-l1/pd-1結(jié)合，對(duì)肝癌細(xì)胞具有雙重抑制作用。

35、(3)本發(fā)明通過(guò)密碼子優(yōu)化和表達(dá)條件篩選，成功利用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)雙靶向pd-l1和bfgf的雙特異性diabody抗體。而且，使用該重組載體進(jìn)行表達(dá)，搖瓶培養(yǎng)中每1l發(fā)酵液能獲得17.6mg抗體。