本發(fā)明涉及植物基因工程，具體涉及f-box基因osfbx49在水稻抗褐飛虱中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水稻是最重要的糧食作物之一，世界上有超過一半的人以其為主食。同時，水稻生產(chǎn)直接關(guān)系到我國糧食安全、農(nóng)民增收和農(nóng)村穩(wěn)定。褐飛虱是水稻生產(chǎn)中發(fā)生和為害面積最大的害蟲。褐飛虱的成蟲或若蟲群集于稻叢基部，剌吸韌皮部的汁液，消耗稻株養(yǎng)分。當(dāng)褐飛虱大爆發(fā)時，稻株下部變黑，癱瘓倒伏，稻田成片枯萎，減產(chǎn)甚至失收。據(jù)統(tǒng)計，2006-2015年這十年內(nèi)，我國每年因褐飛虱危害，發(fā)生面積3.87畝次，損失稻谷120噸，占水稻各種病蟲害總損失的29.5%，是我國水稻生產(chǎn)中的頭號害蟲（劉萬才等，2016）。褐飛虱也是亞洲水稻生產(chǎn)中的頭號害蟲，常常使各國水稻損失慘重。尤其是進(jìn)入21世紀(jì)之后，整個亞洲水稻產(chǎn)區(qū)褐飛虱爆發(fā)的頻率和規(guī)模有逐漸擴(kuò)大的趨勢,?目前已經(jīng)成為了水稻生產(chǎn)上最大的威脅，被認(rèn)為是水稻的第一大害蟲（heong?&?hardy,?2009;?irri,?annual?report?2011）。因此，遏制褐飛虱的發(fā)展和危害，是保障水稻生產(chǎn)安全的重大需求。

2、f-box蛋白最初發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞周期蛋白cyclinf中，是scf復(fù)合體中的關(guān)鍵因子（glickman?m.h.?et?al.,2002;?jain?m.,?2007），因其n端含有約40-50個氨基酸組成的f-box基序而被命名為f-box，這些位置由高度保守的leu-pro二肽和其他疏水或支鏈（val和ile）氨基酸的組合占據(jù)。f-box蛋白可以與scf泛素e3連接酶的核心亞基-s期激酶相關(guān)蛋白1（s-phase?kinase-associated?protein?1，skp1）相互作用形成scf復(fù)合體，參與植物生長發(fā)育、植物光形態(tài)建成、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抵抗生物脅迫等過程。f-box蛋白對植物的生長發(fā)育和逆境適應(yīng)均至關(guān)重要，然而，對其在植物抗蟲方面的功能研究很少。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供水稻含f-box結(jié)構(gòu)域蛋白基因osfbx49在提高水稻對褐飛虱抗性中的應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本發(fā)明提供f-box基因osfbx49在提高水稻對褐飛虱抗性中的應(yīng)用，所述基因osfbx49的核苷酸序列為（i）或（ii）：

4、（i）seq?id?no.1所示的核苷酸序列，其orf全長1176?bp，編碼391個氨基酸；

5、（ii）seq?id?no.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸，且與seq?id?no.1所示的核苷酸序列表達(dá)相同蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

6、本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)seq?id?no.?1所示的核苷酸序列，對其替換、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸，獲得具有相同功能的核苷酸序列，例如，在不同水稻背景下的序列，替換或者缺失一個或幾個核苷酸，編碼的氨基酸序列沒有移碼突變，僅僅出現(xiàn)部分氨基酸的缺失或者點突變。因此，本發(fā)明所述的基因osfbx49的核苷酸序列還包括seq?idno.?1所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸，且與seq?id?no.1所示的核苷酸序列表達(dá)相同蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

7、進(jìn)一步地，所述基因osfbx49編碼如下蛋白質(zhì)（a）或（b）：

8、（a）由seq?id?no.?2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

9、（b）seq?id?no.?2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸，且與seq?id?no.?2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能的由（a）衍生的蛋白質(zhì)。

10、本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解為，在不影響基因osfbx49編碼的蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本領(lǐng)域技術(shù)人員可對seq?id?no.?2所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。

11、本發(fā)明提供的f-box基因osfbx49在提高水稻對褐飛虱抗性中的應(yīng)用，所述基因osfbx49的活性和/或表達(dá)量增加，則水稻對褐飛虱的抗性增強(qiáng)，水稻對褐飛虱的抗性增強(qiáng)主要表現(xiàn)在：褐飛虱取食水稻葉鞘后，對照水稻植株死亡，而基因osfbx49超量表達(dá)的植株正常生長；同時，褐飛虱取食超量表達(dá)植株葉鞘后，褐飛虱的存活率降低，其體重的增重降低，分泌的蜜露量減少。

12、第二方面，本發(fā)明提供一種生物材料，其特征在于，所述生物材料含有基因osfbx49，所述生物材料為重組dna、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒載體、病毒載體或工程菌；所述基因osfbx49的核苷酸序列為（i）或（ii）：

13、（i）seq?id?no.1所示的核苷酸序列；

14、（ii）seq?id?no.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸，且與seq?id?no.1所示的核苷酸序列表達(dá)相同蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

15、第三方面，一種基因osfbx49，或權(quán)利要求3所述生物材料在選育具有抗褐飛虱性能的水稻品種中的應(yīng)用，其特征在于，所述基因osfbx49的核苷酸序列為（i）或（ii）：

16、（i）seq?id?no.1所示的核苷酸序列；

17、（ii）seq?id?no.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸，且與seq?id?no.1所示的核苷酸序列表達(dá)相同蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

18、第四方面，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)水稻對褐飛虱抗性的方法，包括：利用基因工程手段，使osfbx49基因的活性和/或表達(dá)量增加。

19、進(jìn)一步地，所述基因工程包括：構(gòu)建osfbx49基因的超量表達(dá)載體，用該載體轉(zhuǎn)化水稻。

20、更進(jìn)一步地，所述超量表達(dá)載體采用常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中，所述常規(guī)生物技術(shù)方法包括但不限于使用ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔。

21、更進(jìn)一步地，所述超量表達(dá)載體采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入植物細(xì)胞中，用于轉(zhuǎn)化水稻。

22、第五方面，本發(fā)明提供采用所述方法獲得的轉(zhuǎn)基因水稻在水稻育種中的應(yīng)用。

23、進(jìn)一步地，所述育種的方法包括：轉(zhuǎn)基因、雜交、回交、自交或無性繁殖。

24、本發(fā)明所述osfbx49基因的發(fā)現(xiàn)與功能驗證：

25、（1）發(fā)現(xiàn)過程：通過對抗、感褐飛虱水稻的轉(zhuǎn)錄組分析中，發(fā)現(xiàn)了一個抗褐飛虱水稻中受褐飛虱取食，上調(diào)表達(dá)的基因osfbx49。

26、（2）遺傳轉(zhuǎn)化驗證功能：構(gòu)建osfbx49基因超量表達(dá)載體，載體骨架是含有ubiquinti啟動子的pcxun載體，采用農(nóng)桿菌eha105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超量表達(dá)載體導(dǎo)入感蟲水稻中，篩選轉(zhuǎn)基因植株，最后獲得osfbx49基因超量表達(dá)的陽性轉(zhuǎn)基因水稻植株；對t2代的植株進(jìn)行了定量pcr分析，挑選2個具有代表性的相對表達(dá)量較高的株系（osfbx49-1、osfbx49-6）進(jìn)行功能驗證；對t2代的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗蟲鑒定，包括苗期集團(tuán)法、存活率、蟲增重和蜜露量等，發(fā)現(xiàn)這兩個株系對褐飛虱的抗性顯著增強(qiáng)。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益之處在于：

28、本發(fā)明通過增加感蟲水稻品種中osfbx49基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻植株抗蟲性增強(qiáng)，本發(fā)明首次揭示了osfbx49基因增強(qiáng)了水稻對褐飛虱的抗性，可以用于植物抗蟲反應(yīng)的研究；植物細(xì)胞中的osfbx49基因成員很多，參與多種生物學(xué)功能，因此，本發(fā)明對osfbx49基因的研究對于后續(xù)研究其他的含f-box結(jié)構(gòu)域蛋白成員具有很好的參考價值。