本發(fā)明屬于生物發(fā)酵，具體涉及一種高效的生物發(fā)酵催化劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、酶的固定化是生物技術(shù)和生物催化中的一項重要技術(shù)。固定化酶具有以下優(yōu)勢：固定化酶可以在不使用有害溶劑的條件下進行催化反應(yīng)，有助于實現(xiàn)綠色化學(xué)和可持續(xù)生產(chǎn)過程；固定化可以保護酶免受高溫、極端ph值或機械剪切等惡劣條件的影響，從而提高其熱穩(wěn)定性、ph穩(wěn)定性等；固定化酶具有更高的催化效率，酶在固定化載體上的濃度較高，易于與底物接觸；可以將不同的酶固定在同一個載體上，實現(xiàn)多酶系統(tǒng)的協(xié)同催化，加速反應(yīng)過程。

2、基于固定化酶的優(yōu)勢，近年來對固定化酶的相關(guān)研究越來越多。專利cn118178524a公開了一種降轉(zhuǎn)氨酶組合物、制備方法及其應(yīng)用，該專利在降轉(zhuǎn)氨酶組合物的制備過程中，使用固定化酶進行預(yù)酶解處理，提高有效成分的溶出。專利cn?117106764?a公開了一種用于制備超低分子鐵皮石斛多糖的固定化復(fù)合酶及其制備方法和應(yīng)用，該申請使用γ-環(huán)糊精制備得到一種耐高溫的固定化酶載體材料，配比不同的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶和纖維素酶，并同時將努比鹵地?zé)o氧芽胞桿菌發(fā)酵獲得的產(chǎn)物酶和中性蛋白酶進行多元復(fù)配，固載到前述制備的載體材料中，得到固定化復(fù)合酶，該固定化復(fù)合酶能夠提高超低分子鐵皮石斛多糖的產(chǎn)率。

3、但是目前對于中藥發(fā)酵相關(guān)的固定酶催化劑的相關(guān)研究較少。近些年中藥有效成分的提取并不局限于之前的溶劑提取方法，中藥的生物發(fā)酵提取的研究越來越多，但只采用微生物對中藥進行發(fā)酵的效果不太理想。

4、因此，研發(fā)一種能夠與微生物配合，高效催化中藥的分解，提高有效成分的溶出，對中藥的生物發(fā)酵具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明公開一種高效的生物發(fā)酵催化劑及其制備方法，制備出的生物發(fā)酵催化劑能夠在較溫和的條件下起到高效催化效果，能夠顯著提高微生物對中藥的發(fā)酵效果，降低中藥的毒性，提高有效物質(zhì)含量。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明第一方面提供了一種高效的生物發(fā)酵催化劑的制備方法，包括以下制備步驟：

4、(1)將聚丙烯酰胺、雙酚a型環(huán)氧樹脂和聚乙二醇混合均勻后，再加入固化劑混合均勻，于75-85℃下固化2-3h，將得到的固體用去離子水洗滌至中性，真空環(huán)境下干燥，得到聚合物模板；

5、(2)將步驟(1)的聚合物模板完全浸泡于正硅酸四乙酯中2.5-3.5h后，在30-35℃下熏氨10-12h，取出復(fù)合物在60-70℃下干燥1.5-2.5h，再以10-15℃/min的速率升溫、煅燒，得到二氧化硅載體；

6、(3)將步驟(2)的二氧化硅載體浸泡在功能溶液中2-3h，再取出置于90-100℃下干燥1-2h后，在200-300℃下煅燒1-1.5h，再升溫至600-650℃煅燒20-30min，將得到的固體1等體積浸漬于鋅鈀混合液中浸泡5-6h，在密閉容器中、90-100℃下水熱反應(yīng)16-20h，冷卻、洗滌、干燥，得到特定載體；

7、(4)將步驟(3)的特定載體用硅烷偶聯(lián)劑進行改性，再將改性的特定載體分散在甲醇中，在0-4℃下向其中逐滴加入丙烯酸，在20-30℃下反應(yīng)20-24h后，分離、洗滌、干燥得到的固體2，再將固體2分散在甲醇中，在0-4℃下，向其中逐滴加入三乙胺，在20-30℃下反應(yīng)20-24h后，分離、洗滌、烘干后，得到改性特定載體；

8、(5)將步驟(4)的改性特定載體等體積浸漬于混合酶溶液中，在10-15℃下浸泡6-10h，分離、洗滌，得到生物發(fā)酵催化劑。

9、在一些實施方式中，所述步驟(1)中聚丙烯酰胺為數(shù)均分子量為200萬-1400萬的非離子聚丙烯酰胺，雙酚a型環(huán)氧樹脂的數(shù)均分子量為700-1500、聚乙二醇的數(shù)均分子量為1000-2000。

10、在一些實施方式中，所述聚丙烯酰胺、雙酚a型環(huán)氧樹脂和聚乙二醇的質(zhì)量比為(6-8):(3.5-4.5):1。

11、優(yōu)選地，所述聚丙烯酰胺、雙酚a型環(huán)氧樹脂和聚乙二醇的質(zhì)量比為7:4:1。

12、在一些實施方式中，所述升溫至700-750℃，煅燒時長為2-4h。

13、優(yōu)選地，所述升溫至725℃，煅燒時長為3h。

14、在一些實施方式中，所述步驟(3)的功能溶液為數(shù)均分子量在400-800的聚乙二醇、zn(ac)2·2h2o溶于去離子水組成；所述功能溶液中聚乙二醇、zn(ac)2·2h2o的濃度分別為8-12wt％、0.5-1mol/l。

15、優(yōu)選地，所述功能溶液中聚乙二醇、zn(ac)2·2h2o的濃度分別為10wt％、0.75mol/l。

16、在一些實施方式中，所述步驟(3)的鋅鈀混合液中鋅離子、鈀離子的濃度分別為0.8-1mol/l、0.02-0.05mol/l。

17、優(yōu)選地，所述步驟(3)的鋅鈀混合液中鋅離子、鈀離子的濃度分別為0.9mol/l、0.035mol/l。

18、在一些實施方式中，所述步驟(4)中特定載體與丙烯酸的質(zhì)量比為(1-2):1；所述固體2與三乙胺的質(zhì)量比為1:(0.8-0.9)。

19、優(yōu)選地，所述步驟(4)中特定載體與丙烯酸的質(zhì)量比為1.5:1；所述固體2與三乙胺的質(zhì)量比為1:0.85。

20、在一些實施方式中，所述步驟(5)中混合酶溶液由木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶分散在去離子水中得到；所述混合酶溶液中木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的濃度分別為1-4wt％、0.5-1wt％。

21、在一些實施方式中，所述木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量比為(4-6):1。

22、優(yōu)選地，所述木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量比為5:1。

23、本發(fā)明第二方面提供了一種根據(jù)以上內(nèi)容所述的制備方法制備得到的生物發(fā)酵催化劑。

24、本發(fā)明通過將兩種功能酶負(fù)載在特定載體上，功能酶能夠與載體中的金屬離子共同作用，提高催化劑對中藥生物發(fā)酵的催化效果。

25、本發(fā)明使用聚丙烯酰胺、雙酚a型環(huán)氧樹脂和聚乙二醇為原料，制備出聚合物模版，該聚合物模版具有優(yōu)異的生物相容性、機械強度和穩(wěn)定性。并通過控制原料比例對聚合物模版的孔隙結(jié)構(gòu)、孔徑分布、親疏水性進行調(diào)控，有利于后續(xù)載體的形成；再將聚合物模板浸泡在正硅酸四乙酯溶液中，正硅酸四乙酯會水解并縮合形成硅醇，這些硅醇通過聚合反應(yīng)形成三維的二氧化硅網(wǎng)絡(luò)，再通過煅燒，得到具有大孔結(jié)構(gòu)、高比表面積的二氧化硅載體，有利于提高催化劑的傳輸效率和催化反應(yīng)的進行；并將此二氧化硅載體浸泡在功能溶液中，再進行煅燒，得到的固體1的內(nèi)部結(jié)構(gòu)具有凸起，增加吸附點位，有利于后續(xù)金屬離子和酶的附著，再在固體1上負(fù)載一定量的鋅和鈀金屬離子，一方面兩種金屬自身也具有一定的催化作用，另一方面它們的電荷、粗糙度和化學(xué)組成，可能通過提供特定的化學(xué)環(huán)境或電子特性，影響酶的吸附、穩(wěn)定性和兩種酶的相互作用，進而影響它們的催化活性，此外，本發(fā)明還通過偶聯(lián)劑、丙烯酸和三乙胺對特定載體進行改性，提高酶在載體上的附著力、穩(wěn)定性和催化效果。

26、申請人發(fā)現(xiàn)將木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶固定在改性特定載體上，二者的穩(wěn)定性高，催化活性能夠互補，減少不必要的副反應(yīng)和副產(chǎn)物的生成，提高催化效率。這是由于，一方面將兩種酶固定在同一個載體上或通過特定的空間排列，可以優(yōu)化它們的協(xié)同作用，實現(xiàn)更接近的物理接近性和更有效的底物通道；另一方面木聚糖酶主要負(fù)責(zé)水解各中藥中木聚糖的β-1,4-糖苷鍵，生成低聚木糖和木糖，而β-葡萄糖苷酶則可以進一步將這些低聚木糖水解，提高有效成分的溶出，這兩種酶的協(xié)同作用可以更有效地將木聚糖完全降解。且其中一種酶的活性可能受到另一種酶活性產(chǎn)物的激活，從而提高整個催化過程的效率。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

28、1、本發(fā)明通過將兩種功能酶負(fù)載在特定載體上，功能酶能夠與載體中的金屬離子共同作用，提高催化劑對中藥生物發(fā)酵的催化效果，且該生物發(fā)酵催化劑能夠在較溫和的條件下起到高效催化效果，顯著提高微生物對中藥的發(fā)酵效果，降低中藥的毒性，提高有效物質(zhì)含量。

29、2、本發(fā)明制備出一種改性特定載體，具有特定的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和附著位點，能夠提高酶在載體上的附著力、穩(wěn)定性和催化效果。

30、3、本發(fā)明將木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶固定在改性特定載體上，二者的穩(wěn)定性高，催化活性能夠互補，減少不必要的副反應(yīng)和副產(chǎn)物的生成，提高催化效率。