本發(fā)明涉及一種凍存臍帶血造血干細(xì)胞來源的nk細(xì)胞的制備方法，屬于免疫細(xì)胞。

背景技術(shù)：

1、nk細(xì)胞，全稱為自然殺傷細(xì)胞（natural?killer?cells），是一類重要的免疫細(xì)胞，屬于先天免疫系統(tǒng)的核心成員。它們的主要功能是識別并殺死腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞，是機(jī)體抗腫瘤和抗病毒的第一道防線。目前nk細(xì)胞可以通過以下幾種途徑獲?。和庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞（pbmcs）、臍帶血（ucb）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（ipscs）、nk細(xì)胞系、骨髓、胚胎干細(xì)胞（escs）等。其中臍帶血來源的nk細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)：采集時(shí)供體無痛苦和風(fēng)險(xiǎn)；含有較多的未成熟的免疫細(xì)胞，易于培養(yǎng)和激活；增殖能力和骨髓歸巢能力強(qiáng)；較低的免疫原性和gvhd風(fēng)險(xiǎn)；對腫瘤微環(huán)境的適應(yīng)性更強(qiáng)，能夠更好地適應(yīng)不同腫瘤的內(nèi)部環(huán)境，提高治療效果。這些優(yōu)點(diǎn)使得臍帶血來源的nk細(xì)胞正在成為免疫治療領(lǐng)域的一個(gè)重要方向。但是，利用冷凍后的臍帶血造血干細(xì)胞培養(yǎng)nk細(xì)胞是當(dāng)前的難點(diǎn)。

2、眾所周知，冷凍后的臍帶血細(xì)胞是很脆弱的，其中的免疫細(xì)胞更加的脆弱，在程控降溫和復(fù)蘇過程中，細(xì)胞膜和主要的細(xì)胞器膜均可能存在冰晶損傷，而且細(xì)胞表面很多受體蛋白可能在冷凍復(fù)蘇過程中脫落，從而會影響細(xì)胞的增殖。同時(shí)，臍帶血細(xì)胞在解凍時(shí)，死細(xì)胞（主要是粒細(xì)胞）極易聚集并形成團(tuán)塊，使得與活細(xì)胞難于分離，影響后續(xù)的培養(yǎng)過程，這點(diǎn)是目前大多數(shù)文獻(xiàn)未考慮到的。冷凍過的臍帶血再進(jìn)行提取單個(gè)核細(xì)胞（cbmc）與新鮮臍帶血提取單個(gè)核細(xì)胞相比誘導(dǎo)成nk細(xì)胞步驟是不同的，原因是經(jīng)過冷凍后細(xì)胞變得比較脆弱，需要在提取單個(gè)核細(xì)胞后迅速恢復(fù)并激活其中的免疫細(xì)胞，使其誘導(dǎo)成nk細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道使用4℃預(yù)冷的復(fù)蘇溶液復(fù)蘇凍存臍帶血造血干細(xì)胞，但細(xì)胞在37℃的水浴解凍而后又加入4℃預(yù)冷的復(fù)蘇溶液會使細(xì)胞（尤其是其中的免疫細(xì)胞）變得更加脆弱。發(fā)明專利申請cn117286101?a公開了一種高效擴(kuò)增凍存臍帶血中自然殺傷細(xì)胞的方法，其使用的是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，在臨床上使用存在動(dòng)物源成分的安全問題，而且其混有大量紅細(xì)胞，會影響免疫細(xì)胞的后續(xù)生長，且存在擴(kuò)增倍數(shù)低的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種凍存臍帶血造血干細(xì)胞來源的nk細(xì)胞的制備方法。

2、本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、一種凍存臍帶血造血干細(xì)胞來源的nk細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

4、（一）臍帶血復(fù)蘇：取凍存臍帶血，水浴快速融化，加入37℃的復(fù)蘇溶液（事先溫浴好）；離心，棄上清，得血樣；

5、（二）分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞：使用淋巴細(xì)胞分離液分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，并加入氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞，采用清洗溶液洗滌，得單個(gè)核細(xì)胞；

6、（三）nk細(xì)胞的誘導(dǎo)制備：向經(jīng)lymactin-nk包被的培養(yǎng)瓶中加入激活培養(yǎng)基，將臍帶血單個(gè)核細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶，加入il-21、il-18、抗凋亡劑、bdnf、ngf、tpo和sdf-1（添加后，il-21、il-18、抗凋亡劑、bdnf、ngf、tpo和sdf-1的濃度分別為20?ng/ml、10?ng/ml、20mm、50μg/ml、50μg/ml、50μg/ml和50μg/ml），置于5%co2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)的第3天和第5天，補(bǔ)加激活培養(yǎng)基；培養(yǎng)的第7天開始，每2天補(bǔ)加擴(kuò)增培養(yǎng)基；培養(yǎng)的第17～20天收集細(xì)胞，即得nk細(xì)胞；

7、所述激活培養(yǎng)基是由kbm581培養(yǎng)基和il-15組成的，il-15的濃度為20?ng/ml；

8、所述擴(kuò)增培養(yǎng)基是由kbm581培養(yǎng)基和il-2組成的，il-2的濃度為1000?iu/ml。

9、進(jìn)一步地，所述步驟（一）中，水浴融化時(shí)的水浴溫度為40℃。

10、進(jìn)一步地，所述步驟（一）中，復(fù)蘇溶液是由以下溶液配制而成的：140?ml的0.9%（mg/ml）氯化鈉注射液，50?ml的復(fù)方電解質(zhì)溶液，10?ml的人血白蛋白溶液（人血白蛋白的濃度為20%，g/l）。

11、進(jìn)一步地，所述步驟（一）中，加入37℃的復(fù)蘇溶液時(shí)，邊搖晃邊勻速加入且持續(xù)時(shí)間不少于3分鐘。

12、進(jìn)一步地，所述步驟（一）中，復(fù)蘇溶液的加入量為臍帶血體積的8倍。

13、進(jìn)一步地，所述步驟（二）中，氯化銨溶液的濃度為0.8%（單位：g/100ml）。

14、進(jìn)一步地，所述步驟（二）中，清洗溶液是通過以下方法配制而成的：向200?ml的0.9%氯化鈉溶液中加入2?ml的dnaseⅰ溶液（1?mg/ml）和1.5?ml的mgcl2溶液（25?mm），混勻，即得。

15、進(jìn)一步地，所述步驟（二）的具體操作如下：

16、（1）鋪層加樣：血樣以2:1比例緩慢勻速加入到人淋巴細(xì)胞分離液上層，離心；

17、（2）提取單個(gè)核細(xì)胞：離心后，離心管內(nèi)出現(xiàn)明顯的分層，吸取單個(gè)核細(xì)胞層（白膜層）；

18、（3）第一遍洗滌：向單個(gè)核細(xì)胞中加入等體積的清洗溶液，離心，棄上清，得細(xì)胞沉淀；

19、（4）裂解紅細(xì)胞：加入3倍（體積倍數(shù)）的濃度為0.8%的氯化銨溶液稀釋細(xì)胞沉淀，混勻，4℃裂解10?min，得裂解液；

20、（5）第二遍洗滌：向裂解液中加入清洗溶液終止裂解并洗滌，離心，棄上清，得細(xì)胞沉淀；

21、（6）第三遍洗滌：加入清洗溶液洗滌細(xì)胞，離心，棄上清，即得單個(gè)核細(xì)胞。

22、進(jìn)一步地，所述步驟（三）中，包被的具體方式為：用4?ml的pbs緩沖液和1?ml的lymactin-nk溶液包被非tc處理的t75培養(yǎng)瓶1?h以上，去除包被液，用pbs緩沖液清洗掉殘留的包被液。

23、進(jìn)一步地，所述步驟（三）中，培養(yǎng)的第3天補(bǔ)加的激活培養(yǎng)基的量為：初始激活培養(yǎng)基的90%～110%，優(yōu)選100%。

24、進(jìn)一步地，所述步驟（三）中，培養(yǎng)的第5天補(bǔ)加的激活培養(yǎng)基的量為：初始激活培養(yǎng)基的350%～450%，優(yōu)選400%。

25、進(jìn)一步地，所述步驟（三）中，培養(yǎng)的第7天開始，每隔2天補(bǔ)加擴(kuò)增培養(yǎng)基以調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml。

26、利用上述方法制備得到的nk細(xì)胞。

27、本發(fā)明的凍存臍帶血造血干細(xì)胞來源的nk細(xì)胞的制備方法，采用37℃提前溫浴好的復(fù)蘇溶液復(fù)蘇臍帶血細(xì)胞，并在洗滌過程中使用清洗溶液，清洗溶液含有氯化鈉、dnase和mgcl2，防止細(xì)胞結(jié)團(tuán)。加入氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞，以減少紅細(xì)胞對后續(xù)培養(yǎng)的影響。利用此方法獲得數(shù)量足夠、狀態(tài)良好、細(xì)胞潛能良好的臍帶血單個(gè)核細(xì)胞后，在激活時(shí)加入多種激活因子（抗細(xì)胞凋亡劑、bdnf、ngf、sdf-1、tpo等），促使細(xì)胞恢復(fù)凍存前的狀態(tài)，使其被誘導(dǎo)并被激活，最終經(jīng)培養(yǎng)獲得nk細(xì)胞。

28、本發(fā)明的凍存臍帶血造血干細(xì)胞來源的nk細(xì)胞的制備方法，具有以下優(yōu)勢：

29、（1）本發(fā)明使用37℃提前溫浴好的復(fù)蘇保護(hù)液復(fù)蘇臍帶血細(xì)胞，相比于文獻(xiàn)報(bào)道的4℃預(yù)冷后的復(fù)蘇保護(hù)液，能夠更好的保護(hù)細(xì)胞。

30、（2）經(jīng)過冷凍后的臍帶血復(fù)蘇后比較脆弱，不適合長時(shí)間在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行ficoll法的分離，會影響單個(gè)核細(xì)胞的富集和最終細(xì)胞的狀態(tài)，但不經(jīng)ficoll法分離會殘留大量的紅細(xì)胞，本發(fā)明經(jīng)過多次嘗試，使用ficoll法提取臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，提取臍帶血單個(gè)核細(xì)胞的清洗過程中使用清洗溶液，清洗溶液中含有氯化鈉、dnase和mgcl2，可防止細(xì)胞結(jié)團(tuán)，能夠保護(hù)單個(gè)核細(xì)胞的富集和最終的細(xì)胞狀態(tài)。在離心前加入氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞，極大的降低了紅細(xì)胞對后續(xù)培養(yǎng)的影響。

31、（3）相比于新鮮的臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，從冷凍過的臍帶血中提取單個(gè)核細(xì)胞最重要的就是盡可能恢復(fù)其細(xì)胞狀態(tài)到新鮮細(xì)胞狀態(tài)。本發(fā)明在常規(guī)培養(yǎng)nk細(xì)胞方法的基礎(chǔ)上，在激活當(dāng)天再加入一些細(xì)胞因子（如抗細(xì)胞凋亡劑、bdnf、ngf、sdf-1、tpo等），加入的抗細(xì)胞凋亡劑在細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)揮著重要作用，它們通過抑制細(xì)胞凋亡過程來維持細(xì)胞的生存和功能。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，對于去除損傷或不再需要的細(xì)胞至關(guān)重要，然而，在細(xì)胞培養(yǎng)中，過度的細(xì)胞凋亡可能導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，抗細(xì)胞凋亡劑的使用可以幫助維持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)。

32、（4）本發(fā)明后續(xù)培養(yǎng)僅采用kbm581培養(yǎng)基加il-2擴(kuò)增培養(yǎng)基，在節(jié)約成本的同時(shí)，極大地提高冷凍后臍帶血復(fù)蘇培養(yǎng)nk的擴(kuò)增倍數(shù)并保持其表型同新鮮臍血nk細(xì)胞。

33、（5）除此之外本發(fā)明的制備方法為純因子培養(yǎng)法，無滋養(yǎng)層細(xì)胞，所使用的試劑均為市售試劑，無需滅菌處理，不含動(dòng)物源成分，可達(dá)到臨床級別。

34、本發(fā)明的凍存臍帶血造血干細(xì)胞來源的nk細(xì)胞的制備方法，對于存儲了臍帶血（而未被應(yīng)用于治療或者不屬于臍帶血造血干細(xì)胞治療技術(shù)的適應(yīng)證范疇）的儲戶而言多了一份選擇，可以選擇培養(yǎng)nk細(xì)胞。隨著技術(shù)的發(fā)展，nk細(xì)胞治療的潛力會大大提高，而nk細(xì)胞治療的疾病種類也會隨之提高。對于社會而言，公共臍血庫在使用時(shí)需要配型，但同時(shí)也存在使用不上的情況，會存在比較大的資源浪費(fèi)；本發(fā)明能夠解決目前公共血庫現(xiàn)狀，同時(shí)提高了nk細(xì)胞的擴(kuò)增效率和產(chǎn)量，降低治療成本，使得更多的患者能夠負(fù)擔(dān)得起這種治療，使得更多的臍帶血被充分利用，市場前景廣闊。總之，臍帶血來源的nk細(xì)胞治療作為一種新興的免疫療法，具有巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。通過不斷研究和技術(shù)創(chuàng)新，克服現(xiàn)有的技術(shù)瓶頸，可以進(jìn)一步推動(dòng)nk細(xì)胞治療的發(fā)展，為患者帶來更多的治療希望。同時(shí)，這也將促進(jìn)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為社會經(jīng)濟(jì)帶來積極的影響。

35、本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義。