本發(fā)明涉及on-off型熒光探針，尤其是涉及一種用于檢測(cè)hg2+的on-off型熒光探針及其制備方法和檢測(cè)應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、汞（hg）是一種具有神經(jīng)毒性的持久性環(huán)境污染物和生物富集性重金屬，會(huì)導(dǎo)致土壤微生物群落減少，造成農(nóng)作物減產(chǎn)以及糧食重金屬超標(biāo)。汞在大氣中的停留時(shí)間為0.8-1.7年，允許限值為0.002?mg/l。汞化合物對(duì)人類具有很大的危害性，少量的汞化合物即對(duì)人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，致使視聽(tīng)障礙及運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀，還會(huì)對(duì)人的生殖系統(tǒng)造成影響。由于hg2+造成的水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境污染和水產(chǎn)品安全問(wèn)題正引起國(guó)內(nèi)外關(guān)注，因此迫切需要對(duì)hg2+進(jìn)行快速實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方法。目前，原子吸收光譜法、冷蒸汽原子熒光光譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法等被廣泛應(yīng)用于hg2+的檢測(cè)。但這些技術(shù)需要復(fù)雜的樣品制備、耗時(shí)的程序和昂貴的儀器。

2、on-off型熒光探針?是一種能夠通過(guò)熒光信號(hào)的變化來(lái)檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的存在與否的化學(xué)傳感器。這種探針在目標(biāo)物質(zhì)存在時(shí)熒光信號(hào)會(huì)開(kāi)啟（on），而在沒(méi)有目標(biāo)物質(zhì)時(shí)熒光信號(hào)會(huì)關(guān)閉（off），因此得名on-off型熒光探針。其工作原理基于熒光團(tuán)和猝滅劑之間的相互作用。當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)與熒光團(tuán)結(jié)合時(shí)，猝滅劑被移除或屏蔽，導(dǎo)致熒光信號(hào)開(kāi)啟；當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)不存在時(shí)，猝滅劑與熒光團(tuán)接近，導(dǎo)致熒光信號(hào)關(guān)閉?。

3、on-off型熒光探針在實(shí)際應(yīng)用中具有優(yōu)異的表現(xiàn)，特別是在檢測(cè)重金屬離子等方面表現(xiàn)突出，操方便作，不需要借助昂貴的儀器，非常適用于重金屬離子的實(shí)時(shí)或原位檢測(cè)。但是on-off型熒光探針通常需要復(fù)雜的合成步驟，甚至涉及數(shù)十種中間產(chǎn)物，加大了探針的制備難度，此外，on-off型熒光探針?lè)€(wěn)定性和選擇性較差，在某些復(fù)雜樣品或者極端ph中可能會(huì)受到干擾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能夠降低合成難度，且選擇性好、靈敏度和準(zhǔn)確性高的用于檢測(cè)hg2+的on-off型熒光探針及其制備方法和檢測(cè)應(yīng)用。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種用于檢測(cè)hg2+的on-off型熒光探針，所述的on-off型熒光探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式（i）所示，

3、（i）。

4、本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)hg2+的on-off型熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

5、步驟1：將n-乙基咔唑和zncl2混合后在氮?dú)夥諊Ｗo(hù)下，加入二氯甲烷和乙酰氯作為反應(yīng)溶劑反應(yīng)完全后，得到化合物1，其結(jié)構(gòu)式如下式（ⅱ）所示，

6、（ⅱ）；

7、步驟2：將化合物1溶于乙酸中，再加入乙酸銨和丙二腈反應(yīng)完全后，得到淡黃色固體即為化合物2，其結(jié)構(gòu)式如下式（ⅲ）所示，

8、（ⅲ）；

9、步驟3：將化合物2和對(duì)二羥基苯甲醛加入乙醇中，并加入哌啶為反應(yīng)催化劑反應(yīng)完全后，得到化合物3，其結(jié)構(gòu)式如下式（ⅳ）所示，

10、?（ⅳ）；

11、步驟4：將化合物3溶于二氯甲烷中，并加入戴斯-馬丁試劑反應(yīng)完全后，得到化合物4，其結(jié)構(gòu)式如下式（ⅴ）所示，

12、（ⅴ）；

13、步驟5：將化合物4溶解于二氯甲烷中，并加入乙二硫醇和三氟化硼乙醚反應(yīng)完全后，得到淡黃色固體化合物即為用于檢測(cè)hg2+的on-off型熒光探針，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（i）所示，

14、（i）。

15、進(jìn)一步，具體步驟如下：

16、步驟1：稱取5.5～6.5?g?n-乙基咔唑和8～9.5?g?zncl2置于三頸瓶中，抽氣使三頸瓶中的真空度達(dá)到0.2～0.4?mpa后，向三頸瓶中充入氮?dú)庠诘獨(dú)夥諊Ｗo(hù)下，向瓶?jī)?nèi)加入60～80?ml二氯甲烷和2～4?ml乙酰氯作為反應(yīng)溶劑，在40℃下加熱回流6～8?h反應(yīng)完成后，將反應(yīng)產(chǎn)物倒入hcl溶液中終止反應(yīng)，采用二氯甲烷萃取三次，取有機(jī)層溶液在37～46℃下旋干，得到化合物1，其結(jié)構(gòu)式如式（ⅱ）所示；

17、步驟2：稱取1～1.6?g化合物1溶于10～15?ml溫度為0～2℃的乙酸中，在40℃下攪拌溶解，待化合物1完全溶解后，加入0.65～0.9?g乙酸銨和0.4～1?ml丙二腈，加熱回流12～24?h反應(yīng)完成后，將反應(yīng)產(chǎn)物液倒入純水中終止反應(yīng)，再加入200?ml二氯甲烷萃取三次，取有機(jī)層加入10～15?g干燥劑震蕩10?min，再采用由石油醚和乙酸乙酯按體積比20:1混合而成的混合液作為層析液，進(jìn)行硅膠柱層析，取硅膠柱中黃色部分溶液，隨后在32～37℃下旋干，得到淡黃色固體即為化合物2，其結(jié)構(gòu)式如式（ⅲ）所示；

18、步驟3：稱取160～180?mg化合物2和60～75?mg對(duì)二羥基苯甲醛加入10?ml乙醇中，滴加50～80?μl哌啶為反應(yīng)催化劑，加熱回流8～10?h反應(yīng)完成后，將反應(yīng)產(chǎn)物降至室溫并過(guò)濾除去溶劑，得到化合物3，其結(jié)構(gòu)式如式（ⅳ）所示；

19、步驟4：稱取300～320?mg化合物3溶于10?ml二氯甲烷中，加入300～320?mg戴斯-馬丁試劑，在室溫下攪拌反應(yīng)2～6?h，隨后加入飽和硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，并用200?ml二氯甲烷萃取三次，取有機(jī)層加入20～40?ml飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉的混合溶液，震蕩、洗滌并過(guò)濾，向過(guò)濾后的溶液中加入10～15?g干燥劑震蕩10?min，隨后在37～45℃下旋干，得到化合物4，其結(jié)構(gòu)式如式（ⅴ）所示；

20、步驟5：稱取500～545?mg化合物4溶解于10?ml二氯甲烷中，加入150?μl乙二硫醇，于-2～0℃冰浴反應(yīng)30～45?min，隨后加入150μl三氟化硼乙醚，冰浴反應(yīng)10?min后轉(zhuǎn)移至室溫，繼續(xù)反應(yīng)12～16?h反應(yīng)完成后，在反應(yīng)產(chǎn)物中加入飽和碳酸氫鈉溶液終止反應(yīng)，再加入200?ml二氯甲烷萃取三次，取有機(jī)層加入10-15?g干燥劑震蕩10?min，再采用由石油醚和乙酸乙酯按體積比3:1混合而成的混合液作為層析液，進(jìn)行硅膠柱層析，取硅膠柱中黃色溶液在32～42℃下旋干，得到淡黃色固體化合物即為用于檢測(cè)hg2+的on-off型熒光探針，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（i）所示。

21、進(jìn)一步，所述的干燥劑為硫酸鈣、硫酸鈉和硫酸鎂中的任一種。

22、本發(fā)明還提供一種利用上述on-off型熒光探針檢測(cè)hg2+的方法，包括以下步驟：將on-off型熒光探針溶于由甲醇和hepes緩沖液按體積比（4～6）：（6～4）混合而成的溶劑體系中，得到濃度為10?μmol/l的on-off型熒光探針溶液，將on-off型熒光探針溶液調(diào)節(jié)ph為5.5～6.5后，取on-off型熒光探針溶液與待測(cè)液按體積比9:1的比例加入比色皿中，反應(yīng)30s，設(shè)置熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長(zhǎng)為390?nm，測(cè)定比色皿在發(fā)射波長(zhǎng)590?nm處的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度值與hg2+濃度之間的線性關(guān)系，計(jì)算獲得待測(cè)液中hg2+的濃度。

23、優(yōu)選的，所述的溶劑體系中甲醇和hepes緩沖液的體積比為5:5。

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明一種用于檢測(cè)hg2+的on-off型熒光探針及其制備方法和檢測(cè)應(yīng)用，hg2+具有親硫性，能夠與含硫代取代基的基團(tuán)（如硫代酰胺、硫脲、硫酮等）配位發(fā)生開(kāi)環(huán)和汞雙硫腙反應(yīng)生成汞雙硫腙配合物，從而改變探針的熒光強(qiáng)度達(dá)到檢測(cè)hg2+的目的。利用2-[1-(9-乙基咔唑-3-基)乙亞基]丙二腈的熒光發(fā)色特性及4-(1,3-二硫戊環(huán))苯甲醛識(shí)別效應(yīng)構(gòu)建“on-off”型熒光探針不僅能夠降低合成難度，減少副產(chǎn)物的生成，還具有優(yōu)異的穩(wěn)定性和選擇性，在實(shí)際水樣中可用于低濃度hg2+的識(shí)別檢測(cè)。