本發(fā)明涉及一種甘露聚糖結(jié)合凝集素改造蛋白ppg-rep-mbl、dna分子、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞，以及在制備預(yù)防或/和治療冠狀病毒感染的藥物中的用途，屬于生物醫(yī)藥。

背景技術(shù)：

1、甘露聚糖結(jié)合凝集素（mbl）作為先天免疫的重要組分、補(bǔ)體激活過程中（補(bǔ)體凝集素途徑）的固有成分，其在病毒感染中的識(shí)別和調(diào)節(jié)功能引起了廣泛關(guān)注。人源的mbl具有明顯的抗細(xì)菌、抗病毒活性，具有良好的成藥性。從開發(fā)新藥的合理性來看，把?mbl?作為一種藥物應(yīng)用于人體本身，相較于外源蛋白將具有低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。但是，若將mbl以藥用蛋白的形式大量注入體內(nèi)，必然會(huì)導(dǎo)致補(bǔ)體凝集素途徑（補(bǔ)體系統(tǒng)）的過度激活以及過度促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬等問題，引發(fā)各類不良反應(yīng)，使機(jī)體發(fā)生炎癥性損傷甚至死亡。因此，在具有炎癥的嚴(yán)重疾病過程中，平衡或控制補(bǔ)體系統(tǒng)激活與抑制不良反應(yīng)，但不破壞其保護(hù)功能成為了當(dāng)下研究的重點(diǎn)。

2、目前關(guān)于mbl的研究報(bào)道，主要集中在具體序列的功能。如ying?l?等人報(bào)道，人mbl?基因的膠原樣區(qū)（?clr?）中的三個(gè)點(diǎn)突變?cgt?52?tgt、ggc?54?gac?和?gga?57?gaa會(huì)導(dǎo)致?mbl?突變體蛋白結(jié)合甘露聚糖的能力比野生型?mbl?蛋白降低很多，并且mbl?突變體不能有效地激活補(bǔ)體凝集素途徑。（ying?l?,feng-ling?l?,zhi-jun?b?,?etal.defective?activities,?but?not?secretions,?resulting?from?gene?pointmutations?of?human?mannan-binding?lectin.[j].molecular?medicine?reports,2012,5(4):?1121-7.）russell?w?等人對(duì)大鼠?mbl?進(jìn)行了兩種突變?(g25d和g28e)。發(fā)現(xiàn)?g28e突變體激活補(bǔ)體的效率比?g25d?突變體低?10?倍以上，而?g25d?突變體的活性又比野生型mbl?低?7?倍。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)兩種突變體?mbl?導(dǎo)致的補(bǔ)體激活減少是由于?masp-2?在與甘露聚糖包被表面結(jié)合時(shí)未能被有效激活。kurata?h?等人分別從肝臟和血清中純化并鑒定了肝臟?mbl?(l-mbl)?和血清?mbl?(s-mbl)?兩種形式的人類?mbl，發(fā)現(xiàn)在人類肝臟中新合成的?mbl?在翻譯后被加工成以上兩種形式，二者間相差9個(gè)氨基酸。并在?cos-1?細(xì)胞中合成重組人?mbl，發(fā)現(xiàn)其在膠原樣結(jié)構(gòu)域前端缺乏包含9個(gè)氨基酸殘基（ser-ser-pro-gly-ile-asn-gly-phe-pro）的序列，同時(shí)該蛋白沒有激活補(bǔ)體的能力，表明該序列在人?mbl激活補(bǔ)體過程中起重要作用。（kurata?h,?sannoh?t,?kozutsumi?y,?yokota?y,?kawasaki?t.structure?and?function?of?mannan-binding?proteins?isolated?from?human?liverand?serum.?j?biochem.?1994?jun;115(6):1148-54.）girija,?u.?v?等人發(fā)現(xiàn)?gly-x-y膠原重復(fù)序列?x?位置的賴氨酸殘基，即?ficolin-a?中的lys(56)，對(duì)于?masp-2?結(jié)合至關(guān)重要，該殘基存在于已知可激活補(bǔ)體的所有?ficolin?和?mbl?中，同時(shí)制備了一種?k56p和?m57o?雙突變的重組蛋白，數(shù)據(jù)表明?lys56?和/或?met57?對(duì)與?masp-2?的結(jié)合、對(duì)有效的?masp?激活至關(guān)重要。在大鼠?mbl?中，等效突變（k46p?和?v47o）mbl?蛋白也消除了masp-2?結(jié)合和補(bǔ)體激活。（girija,?u.?v.,?dodds,?a.?w.,?roscher,?s.,?reid,?k.b.,&wallis,?r.?(2007).?localization?and?characterization?of?the?mannose-binding?lectin?(mbl)-associated-serine?protease-2?binding?site?in?ratficolin-a:?equivalent?binding?sites?within?the?collagenous?domains?of?mblsand?ficolins.?journal?of?immunology?(baltimore,?md.?:?1950),?179(1),?455–462.）daming?zuo?等人根據(jù)人?mbl?中的?clr?序列設(shè)計(jì)并合成了一系列肽，這些肽被認(rèn)為可以阻斷mbl-masp?相互作用，以定位人?mbl?上的絲氨酸蛋白酶結(jié)合基序。結(jié)果表明，masp與位于膠原樣結(jié)構(gòu)域鉸鏈區(qū)（由?gly-x-y?重復(fù)序列中斷所形成）的?c?端結(jié)合。此外，發(fā)現(xiàn)r32c、g35d和?g37e突變蛋白與野生型mbl具有相似的絲氨酸蛋白酶結(jié)合特性，但突變型mbl蛋白與masps的結(jié)合遠(yuǎn)弱于野生型mbl蛋白與masps的結(jié)合。（zuo,?d.,?cai,?x.,?zhao,n.,?zhang,?l.,&chen,?z.?(2010).?location?of?mbl-associated?serine?proteasesbinding?motifs?on?human?mannan-binding?lectin?(mbl).?protein?and?peptideletters,?17(1),?131–136）申請(qǐng)?zhí)朿n201910560238.2，發(fā)明名稱：一種含有人igg1fc和甘露聚糖結(jié)合凝集素c端的重組蛋白，供了一種含有人igg1fc和甘露聚糖結(jié)合凝集素c端的重組蛋白及編碼該蛋白的序列得到優(yōu)化的多核苷酸。該發(fā)明還提供了表達(dá)該重組蛋白的制備方法。含有所述序列得到優(yōu)化的多核苷酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白純化后濃度為1.50mg/ml，是密碼子未被優(yōu)化的編碼序列表達(dá)蛋白濃度的3倍。重組蛋白與占血液真菌感染90％以上的5種假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株及臨床株都有很好的結(jié)合活性，證明重組蛋白與5種假絲酵母菌均可結(jié)合，而且此結(jié)合是由于重組蛋白mbl的crd區(qū)介導(dǎo)的。陳阿德等人研究了甘露聚糖結(jié)合凝集素（mbl）對(duì)人中性粒細(xì)胞（pmn）功能的影響。證明mbl以補(bǔ)體凝集素途徑依賴方式增強(qiáng)pmn吞噬功能，并促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌（甘露聚糖結(jié)合凝集素對(duì)人中性粒細(xì)胞功能的影響，j?south?med?univ,?2013,?33(6):?842-846）。

3、mbl為多聚體甘露糖/甘露聚糖糖結(jié)合蛋白，其單鏈分為n端、膠原樣區(qū)（clr）、頸區(qū)與糖識(shí)別區(qū)域（crd）4?個(gè)部分，n端是mbl蛋白3條單體聚合的關(guān)鍵，而頸部和?crd?區(qū)域是mbl?能否識(shí)別并結(jié)合病原體的關(guān)鍵，其氨基酸序列為seq?id?no?.1，核苷酸序列為seq?idno?.2。補(bǔ)體凝集素途徑激活過程中，補(bǔ)體活化的前提是甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶?2（masp2）對(duì)?mbl-clr?中?ogkxgp?短基序的識(shí)別與結(jié)合（ichise,steven?h.?sacks,development?of?a?collagen-like?peptide?polymer?via?end-to-end?disulfidecross-linking?and?its?application?as?a?biomaterial[j].?acta?biomaterialia,2019,?9(4):?361-371），若將該序列替換或刪除會(huì)導(dǎo)致?clr?無法形成膠原樣亞基結(jié)構(gòu)，從而影響?mbl?蛋白的其他生物功能。

4、目前尚無減弱/消除mbl激活補(bǔ)體凝集素途徑作用的文獻(xiàn)報(bào)道，更沒有既減弱/消除mbl對(duì)補(bǔ)體凝集素途徑的激活作用，又能保留其甘露聚糖/甘露糖結(jié)合特性的文獻(xiàn)報(bào)道。

5、由于新型冠狀病毒?(sars-cov-2)?引發(fā)的感染可能會(huì)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的過度激活和高濃度促炎細(xì)胞因子的釋放，從而導(dǎo)致“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。這種炎性細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生可能會(huì)導(dǎo)致疾病進(jìn)展、器官衰竭、急性呼吸窘迫綜合征和死亡。在此背景下，對(duì)于人體免疫系統(tǒng)，特別是先天免疫反應(yīng)及其補(bǔ)體系統(tǒng)，如何應(yīng)對(duì)病毒感染、如何利用這道免疫防線及其相關(guān)蛋白的藥物研發(fā)也成為了研究的重點(diǎn)。

6、目前，已有專利報(bào)道m(xù)bl基因應(yīng)用于sars-cov檢測(cè)試劑?(專利號(hào)：cn200510082997.0)?和重組mbl應(yīng)用于新冠檢測(cè)試劑盒（專利申請(qǐng)?zhí)枺篶n202311287315.4）、重組mbl用于阻斷新冠病毒感染（專利號(hào)cn202110490146.9）以及使用mbl多肽，或其功能片段、衍生物、突變體抑制新冠病毒感染（專利號(hào)：us20240123029a1）。

7、目前尚無降低/阻止補(bǔ)體系統(tǒng)激活的低免疫原性mbl?改造蛋白用于預(yù)防或/和治療冠狀病毒感染的文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，提供了一種低免疫原性可抑制冠狀病毒感染的改造蛋白ppg-rep-mbl，它是發(fā)明人通過改造?mbl?的基因，獲得成功表達(dá)的降低補(bǔ)體系統(tǒng)激活、同時(shí)保證其糖結(jié)合能力的mbl?改造蛋白。本發(fā)明還提供了ppg-rep-mbl的制備方法和用途。

2、本發(fā)明提供了一種甘露聚糖結(jié)合凝集素改造蛋白ppg-rep-mbl，其氨基酸序列如seq?id?no:3?所示，核苷酸序列如?seq?id?no:4?所示。

3、所述的改造蛋白是將?mbl?的膠原樣區(qū)（clr?區(qū)域）中與?masp2?識(shí)別和結(jié)合從而激活補(bǔ)體途徑的?ogkxgp?短基序進(jìn)行替換，參考天然膠原的生物功能序列?cccpp[gpp]4gpr[gpp]4gccc?和保留介導(dǎo)與?c1qr?的結(jié)合從而增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)吞噬細(xì)胞的吞噬作用的motif序列?gekgep。本發(fā)明引入上述膠原序列替換?mbl-clr?區(qū)域以保證膠原樣的形成，但為了使替換后的?mbl?蛋白氨基酸序列長(zhǎng)度更接近于天然?mbl?蛋白氨基酸序列，本發(fā)明引入該膠原序列時(shí)將?pp[gpp]4gpr[gpp]4g?序列進(jìn)行重復(fù)，即引入：cccpp[gpp]4gpr[gpp]4gpp[gpp]4gpr[gpp]4g?序列，只保留?n?端?3?個(gè)半胱氨酸，去掉?c?端?3?個(gè)半胱氨酸，這樣既可以使?n?端cys通過二硫鍵使三螺旋交聯(lián)，同時(shí)不改變?mbl的?c?端?crd?區(qū)域特異性識(shí)別糖殘基的成鍵角度。且為保證改造后的?mbl?蛋白質(zhì)功能的完整性，在序列的?c?末端保留該原位置的motif序列g(shù)ekgep。最終使用cccpp[gpp]4gpr[gpp]4gpp[gpp]4gpr[gpp]4ggekgep?（ppg-rep?肽段）對(duì)其進(jìn)行替換。

4、本發(fā)明還提供了所述的甘露聚糖結(jié)合凝集素改造蛋白ppg-rep-mbl在制備預(yù)防或/和治療冠狀病毒感染的藥物中的用途。

5、其中，所述的藥物是阻斷?sras-cov-2?感染的藥物。

6、其中，所述的sars-cov-2?包括原始毒株和突變毒株。

7、本發(fā)明還提供了所述的甘露聚糖結(jié)合凝集素改造蛋白ppg-rep-mbl的制備方法，它包括如下步驟：

8、a、以野生型甘露聚糖結(jié)合凝集素基因序列seq?id?no:?1為模板，核酸序列為seqid?no:?2，構(gòu)建重組甘露聚糖結(jié)合凝集素ppg-rep-mbl氨基酸序列；將野生型甘露聚糖結(jié)合凝集素的氨基酸序列的mbl-clr?區(qū)域替換為cccpp[gpp]4gpr[gpp]4gpp[gpp]4gpr[gpp]4ggekgep；設(shè)計(jì)合成ppg-rep-mbl基因，氨基酸序列為seq?id?no?.3，核苷酸序列為seq?idno?.4；

9、b、構(gòu)建改造的甘露聚糖結(jié)合凝集素重組質(zhì)粒：將?ppg-rep-mbl?基因插入到載體pcmv3?的hindiii和xbai限制酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建質(zhì)粒pcmv3-ppg。

10、c、制備甘露聚糖結(jié)合凝集素重組蛋白ppg-rep-mbl。

11、根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書計(jì)算好細(xì)胞、質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑之間的比例，在一支無菌ep?管中混勻?dmem?和質(zhì)粒，另一支無菌?ep?管中混勻dmem和?pei?轉(zhuǎn)染試劑，室溫放置?5min。將兩支?ep?管中液體混合翻轉(zhuǎn)混勻，室溫靜置?20min，加入適量混合液體至待轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞中，將細(xì)胞放至?5%?co2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)?6-8h。6h?后，添加?1%its、60μm/l的vc。繼續(xù)培養(yǎng)?72h?后收取含?ppg-rep-mbl?蛋白的細(xì)胞上清液，并加入上清液體積千分之一的pmsf。將上清液用孔徑為?8~12kda?透析袋（md44）裝好，均勻撒上peg20000進(jìn)行濃縮，濃縮至原體積?1/10?左右取出。取?500μlmannan-agarose?瓊脂糖蛋白純化柱置于?10ml?柱狀過濾器中，依次用?15-20?倍柱體積的超純水、15倍柱體積的?tbs-ca2+緩沖液潤(rùn)洗柱材。待緩沖液排干后，用?2倍柱體積的?tbs-ca2+緩沖液重懸柱材，按照每1ml?樣品混合100μl?柱材的比例將?ppg-rep-mbl?蛋白樣品與?mannan-agarose?瓊脂糖純化柱混合，將混合物置于垂直混勻儀上，4℃過夜掛柱。次日，放入?10ml?柱狀過濾器中，排出多余液體，再用?tbs-ca2+緩沖液沖洗柱材，洗除雜蛋白。以含?20mmol/ledta?的?tbs-ca2+洗脫液洗脫?ppg-rep-mbl?蛋白，用離心管收集。再用孔徑為?30kda?的超濾管進(jìn)行超濾，4℃，4000g?離心10min，保留超濾管內(nèi)部的液體。用?20mmoltris-hcl、150mmolnacl（ph=7.4）的透析液過夜透析，透析液每間隔?6-8h?更換一次，得到目的蛋白。

12、本發(fā)明還提供了一種dna分子，所述dna分子編碼所述的甘露聚糖結(jié)合凝集素改造蛋白ppg-rep-mbl。

13、本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有所述的dna分子。

14、本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有所述的表達(dá)載體。

15、本發(fā)明重組甘露聚糖結(jié)合凝集素ppg-rep-mbl具有低免疫原性可抑制新型冠狀病毒。

16、研究報(bào)道，(pro-hyp-gly)10?是一種具有膠原蛋白分子特征的、具有自締合性的三螺旋形式肽，其組裝的許多特征與膠原纖維形成的特征相似。（wuding?zhou,?self-association?of?collagen?triple?helic?peptides?into?higher?order?structures*[j].?journal?of?biological?chemistry,?2006,?281(44):?33-40）cpp(gpp)4gpr(gpp)4gc、ccpp(gpp)5gpr(gpp)5gcc、cccpp(gpp)5gpr(gpp)5gccc、cpp(gpp)4gpr(gpp)4gc、yccpp(gpp)5gpr(gpp)5gccy、ccpp(gpp)4gpr(gpp)4gcc、cccpp(gpp)4gpr(gpp)4gccc?是一系列天然膠原蛋白衍生的生物功能序列，由膠原樣三螺旋肽組成，具有良好的成膠性和流變性。其中?cpp(gpp)4gpr(gpp)4gc、ccpp(gpp)4gpr(gpp)4gcc、cccpp(gpp)4gpr(gpp)4gccc?具有低炎癥性，又以?cccpp(gpp)4gpr(gpp)4gccc?引發(fā)的炎癥性反應(yīng)最低，可以忽略不計(jì)。(ichise,?s.?f.?(2019).?development?of?a?collagen-like?peptide?polymervia?end-to-end?disulfide?cross-linking?and?its?application?as?a?biomaterial.acta?biomaterialia,?94,?361–371.?)。mbl中的motif序列g(shù)ekgep?被證實(shí)可以通過介導(dǎo)與?c1qr?的結(jié)合從而增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)吞噬細(xì)胞的吞噬作用（al-refaei?m?a,?makki?r?m,?alih?m.?structure?prediction?of?transferrin?receptor?protein?1?(tfr1)?byhomology?modelling,?docking,?and?molecular?dynamics?simulation?studies[j].heliyon,?2020,?6(1):?523-528.）。

17、因此利用不含ogkxgp?短基序且可以正常形成膠原樣結(jié)構(gòu)的蛋白序列進(jìn)行替換，在保證替換后膠原樣結(jié)構(gòu)同原始結(jié)構(gòu)相似的前提下，中斷與?masp2?蛋白的結(jié)合，無法形成mbl-masp2?復(fù)合物從而激活下游補(bǔ)體成分，最終不能激活補(bǔ)體凝集素途徑，從而使改造后的?mbl?作為藥物治療時(shí)不過度激活補(bǔ)體系統(tǒng)、引發(fā)炎癥性損傷甚至死亡成為可能。該種策略改造下的低免疫原性?mbl?蛋白成為其安全藥用的研發(fā)突破口，該種策略也是發(fā)明人首次提出的新的策略。

18、本發(fā)明甘露聚糖結(jié)合凝集素重組蛋白ppg-rep-mbl與專利申請(qǐng)?zhí)朿n201910560238.2公開的crd區(qū)域改造的重組甘露聚糖結(jié)合凝集素相比，選擇對(duì)其膠原樣區(qū)進(jìn)行改造，使得ppg-rep-mbl不與msap2蛋白結(jié)合，從而明顯減弱了對(duì)補(bǔ)體凝集素途徑的活化作用。本發(fā)明改造蛋白ppg-rep-mbl與論文（甘露聚糖結(jié)合凝集素對(duì)人中性粒細(xì)胞功能的影響，j?south?med?univ,?2013,?33(6):?842-846）相比，ppg-rep-mbl對(duì)白色念球菌刺激pmn分泌tnf-α和il-6的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于mbl，并且都能被mannan所抑制。與論文（kaurs,?gupta?v?k,?thiel?s,?sarma?p?u,?madan?t.?protective?role?of?mannan-bindinglectin?in?a?murine?model?of?invasive?pulmonary?aspergillosis.[j].?clinicaland?experimental?immunology,?2007,?148?(2):?382-9）重組的rhmbl相比，ppg-rep-mbl由于無法結(jié)合masp2，激活補(bǔ)體產(chǎn)生c4b沉積量明顯少于rhmbl。本發(fā)明對(duì)?ppg-rep-mbl?進(jìn)行masp2蛋白、?s?蛋白、甘露聚糖結(jié)合活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其不與masp2蛋白結(jié)合、對(duì)補(bǔ)體凝集素途徑的活化作用減弱，同時(shí)保留了其與甘露聚糖的結(jié)合能力并能特異結(jié)合s蛋白糖鏈。假病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該改造蛋白能夠有效阻斷新型冠狀病毒對(duì)?hek293t-ace2?細(xì)胞的侵染，能有效中和新型冠狀病毒。

19、本發(fā)明的有益效果是：

20、1.本發(fā)明所述的改造蛋白不與masp2蛋白結(jié)合，從而明顯減弱對(duì)補(bǔ)體凝集素途徑的活化作用，同時(shí)保留其與甘露糖的結(jié)合特性，可以有效結(jié)合并阻斷新型冠狀病毒假病毒及其delta突變株對(duì)hek293t-ace2?細(xì)胞的侵染。

21、2.獲得激活補(bǔ)體能力大為降低但其他生物活性不變的新型mbl蛋白對(duì)抗病菌、抗病毒以及免疫系統(tǒng)疾病等方面的治療有較大推動(dòng)作用，進(jìn)一步本發(fā)明為創(chuàng)制新一代具有抗病毒、且低免疫原性的創(chuàng)新藥物提供理論和技術(shù)支持，同時(shí)為通過補(bǔ)體系統(tǒng)減輕新冠病毒感染所引發(fā)的炎癥反應(yīng)的方向提供基礎(chǔ)研究支持。為高效低毒副作用的新型藥用甘露聚糖結(jié)合凝集素及其未來可能的mbl缺陷病的應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)，同時(shí)為該蛋白被設(shè)計(jì)為開發(fā)廣譜抗冠狀病毒感染的抑制劑或藥物提供候選可能。