本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵，尤其是一種小分子添加物在裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中提高角鯊烯產(chǎn)量的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、角鯊烯是一種不可皂化的親脂性萜類(lèi)化合物，可作為動(dòng)植物中所有類(lèi)固醇生物合成的前體。角鯊烯作為無(wú)環(huán)三萜，是一類(lèi)功能衍生的脂質(zhì)，角鯊烯可從鯊魚(yú)肝油、橄欖、莧菜籽等動(dòng)植物中分離獲得，但由于提取純化的繁瑣工藝，這類(lèi)生產(chǎn)方式有很大的局限性。因此，利用微生物為宿主以持續(xù)、高效、安全的合成角鯊烯是目前研究的熱點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)兩種用于生產(chǎn)角鯊烯的途徑，一條是甲羥戊酸途徑（mva），另一條是非甲羥戊酸途徑（mep）。生物體采取哪種途徑合成角鯊烯，主要取決于生物自身的特點(diǎn)。例如：像細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌這樣的原核生物，是通過(guò)?mep?途徑合成角鯊烯；而像酵母、高級(jí)真菌、植物、動(dòng)物和人這樣的真核生物，是通過(guò)?mva?途徑合成角鯊烯。

2、裂殖壺菌（schizochytrium?sp）是破囊壺菌科的一種海洋真菌，富含油脂，其含油量最高可達(dá)到50%以上，且脂肪酸組成簡(jiǎn)單。裂殖壺菌因發(fā)酵周期短、生長(zhǎng)較快、有完整的mva途徑，被認(rèn)為是是一種極具潛力的角鯊烯工業(yè)發(fā)酵菌株。

3、到目前為止，通過(guò)添加外源化合物提高角鯊烯的方式已經(jīng)廣泛應(yīng)用于裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，主要表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面：中國(guó)專(zhuān)利cn117821530a通過(guò)在培養(yǎng)基中添加mn2+來(lái)增強(qiáng)萜類(lèi)合成途徑中萜烯合酶的活性，從而擾動(dòng)代謝網(wǎng)絡(luò)增加碳流向角鯊烯的生物合成，可有效促進(jìn)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯。中國(guó)專(zhuān)利cn115820749a通過(guò)添加外源化合物-芝麻酚控制裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中角鯊烯的含量，與未加芝麻酚的對(duì)照組相比，加入不同濃度的芝麻酚的實(shí)驗(yàn)組中裂殖壺菌的角鯊烯的含量均能提高。中國(guó)專(zhuān)利cn105803005a通過(guò)在發(fā)酵前或發(fā)酵中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定濃度的外源調(diào)控因子-醇，以提高裂殖壺菌中角鯊烯含量，效果明顯，可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。

4、目前，通過(guò)添加外源特比奈芬來(lái)調(diào)控裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中的角鯊烯含量未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種小分子添加物在裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中提高角鯊烯產(chǎn)量的方法及應(yīng)用。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

3、一種小分子添加物在提高裂殖壺菌中角鯊烯產(chǎn)量方面中的應(yīng)用。

4、進(jìn)一步地，所述小分子添加物為特比奈芬。

5、進(jìn)一步地，所述裂殖壺菌在發(fā)酵過(guò)程中添加外源物質(zhì)特比奈芬；

6、或者，所述裂殖壺菌在發(fā)酵過(guò)程中添加外源抑制劑特比奈芬能夠大幅提高角鯊烯的產(chǎn)量。

7、一種小分子添加物在裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中提高角鯊烯產(chǎn)量的方法，包括以下步驟：

8、（1）活化：將低溫凍存的裂殖壺菌菌株接種于種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化；

9、（2）將得到的活化裂殖壺菌轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基以獲得一代種子；

10、（3）將步驟（2）獲得的一代種子轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)獲得二代種子；

11、（4）將步驟（3）中獲得的二代種子轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)獲得三代種子；

12、（5）將步驟（4）的三代種子轉(zhuǎn)接于含有特比奈芬的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束得到角鯊烯。

13、進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所添加的特比奈芬的濃度為1mg/l-100mg/l。

14、進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)基包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽離子和微量元素，種子培養(yǎng)基的ph為6.5～7.5，且種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖40g/l、硫酸鈉15g/l、酵母粉8g/l、七水硫酸鎂3g/l、磷酸氫二鉀3g/l、氯化鉀0.5g/l、甘油2ml/l、0.2%維生素b1、0.2%維生素b6、0.2%維生素b12，溶劑為水；上述百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

15、進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽離子和特比奈芬，發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為6.5～7.5，且發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖80g/l、硫酸鈉10g/l、酵母粉8g/l、七水硫酸鎂3g/l、磷酸氫二鉀3g/l、氯化鉀0.5g/l、氯化鈣0.2g/l、甘油2ml/l、0.2%維生素b1?、0.2%維生素b6、0.2%維生素b12，溶劑為水；上述百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

16、進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)的條件均為30℃，180rpm培養(yǎng)24h；

17、所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為30℃，180rpm培養(yǎng)120h。

18、進(jìn)一步地，具體步驟如下：

19、（1）將低溫凍存的裂殖壺菌菌株接種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化，鏡檢無(wú)染菌后，將得到的活化裂殖壺菌轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，活化菌的接種量為1%-2%（體積百分?jǐn)?shù)，v/v），并在28-30℃，170-180rpm下培養(yǎng)24h獲得一代種子；

20、（2）將步驟（1）獲得的一代種子，鏡檢無(wú)染菌后，接種于種子培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)，一代種子的接種量為1%-2%（體積百分?jǐn)?shù)，v/v），并在28-30℃，170-180rpm下培養(yǎng)24h，獲得二代種子；

21、（3）將步驟（2）中獲得的二代種子，鏡檢無(wú)染菌后，接種于種子培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)，二代種子的的接種量為1%-2%（v/v），并在28-30℃，170-180rpm下培養(yǎng)24h，獲得三代種子；

22、（4）將步驟（3）的三代種子，鏡檢無(wú)染菌后，將三代種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為8%-10%（v/v，體積比），于28-30℃的溫度及170-180rpm的轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)120h，在此期間，在發(fā)酵36h時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入100mg/l濃度的特比奈芬，發(fā)酵結(jié)束得到角鯊烯。

23、進(jìn)一步地，所述步驟（1）中活化菌的接種量為1%（體積百分?jǐn)?shù)，v/v），并在30℃，180rpm下培養(yǎng)24h獲得一代種子；

24、步驟（2）中一代種子的的接種量為2%（體積百分?jǐn)?shù)，v/v），并在30℃，180rpm下培養(yǎng)24h獲得二代種子；

25、步驟（3）中二代種子的的接種量為2%（體積百分?jǐn)?shù)，v/v），并在30℃，180rpm下培養(yǎng)24h獲得三代種子；

26、步驟（4）中將三代種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為8%（v/v，體積比），于30℃的溫度及180rpm的轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)120h。

27、進(jìn)一步地，所述裂殖壺菌為裂殖壺菌schizochytrium?sp.hx-308。

28、本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為：

29、1、本發(fā)明通過(guò)在裂殖壺菌發(fā)酵體系中添加小分子物質(zhì)特比奈芬以提高裂殖壺菌生產(chǎn)角鯊烯的產(chǎn)量。少量特定比例的特比奈芬，可有效抑制裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中角鯊烯被氧化成甾醇類(lèi)物質(zhì)，從而減少角鯊烯的消耗。與未添加特比奈芬相比，添加適宜濃度的特比奈芬，角鯊烯含量是對(duì)照組的2.63倍，角鯊烯占生物量的比是對(duì)照組的2倍。

30、2、本發(fā)明通過(guò)在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中外源添加代謝產(chǎn)物以提高角鯊烯產(chǎn)量的方法，具體利用裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯過(guò)程中，額外添加少量的特比奈芬以提高裂殖壺菌的角鯊烯產(chǎn)量，本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)單的發(fā)酵調(diào)控，可顯著提高裂殖壺菌中角鯊烯含量，同時(shí)特比奈芬價(jià)格低廉，易于獲取，使該方法生產(chǎn)成本相對(duì)降低，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益。

31、3、本發(fā)明方法通過(guò)添加外源物質(zhì)這種簡(jiǎn)單方便、經(jīng)濟(jì)和高效的方式，使最后的角鯊烯產(chǎn)量達(dá)到3.65g/l，然而目前裂殖壺菌schizochytrium屬野生型菌株生產(chǎn)角鯊烯的產(chǎn)量一般在1-2g/l，說(shuō)明本發(fā)明提供的方法具有極高的應(yīng)用潛力。

32、4、本發(fā)明方法發(fā)酵后提取的油脂中經(jīng)檢測(cè)不含特比奈芬，可以確保油脂的純凈與安全、避免藥物殘留問(wèn)題。這些好處使得不含特比奈芬的裂殖壺菌油脂在食品、保健品和化妝品等領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景。

33、5、本發(fā)明方法以裂殖壺菌為生產(chǎn)菌株同時(shí)去除培養(yǎng)基中微量元素的添加來(lái)提高角鯊烯的產(chǎn)量。本發(fā)明通過(guò)在裂殖壺菌發(fā)酵體系中添加外源化合物以提高裂殖壺菌生產(chǎn)角鯊烯的產(chǎn)量。特比奈芬可有效抑制裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中角鯊烯被氧化成甾醇，從而減少角鯊烯的消耗。與未添加特比奈芬相比，在發(fā)酵36h時(shí)添加100mg/l的特比奈芬，角鯊烯含量均得到提高。特比奈芬在裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中能夠抑制角鯊烯環(huán)氧化酶、提高角鯊烯產(chǎn)量。本發(fā)明將特比奈芬應(yīng)用到裂殖壺菌產(chǎn)萜類(lèi)物質(zhì)的調(diào)控中，為提高裂殖壺菌中角鯊烯的含量提供了新的思路，在工業(yè)化生產(chǎn)方面存在巨大的潛力。