本發(fā)明屬于化學(xué)合成，特別涉及一種在微流場(chǎng)中以1-茚醇為起始原料，利用醇脫氫酶和還原性氨基酶合成治療帕金森藥物雷沙吉蘭的方法。

背景技術(shù)：

1、雷沙吉蘭（(r)-n-炔丙基-1-氨基茚滿，(r)-n-2-propynyl-1-indanamine，rasagiline)是第二代單胺氧化酶抑制劑，能阻滯神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的分解，與司來(lái)吉蘭(第一代單胺氧化酶抑制劑)相比抑制作用強(qiáng)5-10倍。單獨(dú)使用作為帕金森?。╬d）早期治療的一線用藥，對(duì)長(zhǎng)期應(yīng)用多巴制劑藥效出現(xiàn)衰退的患者也有改善的作用，可與左旋多巴聯(lián)用治療中、重度帕金森病。雷沙吉蘭的代謝產(chǎn)物是一種無(wú)活性的非苯丙胺物質(zhì)，副作用小。

2、然而，目前合成雷沙吉蘭的方法中，大多數(shù)需要以昂貴的試劑為起始原料，具有包括保護(hù)和去保護(hù)的多個(gè)步驟，與此同時(shí)制備的(r)-1-氨基茚滿具有總產(chǎn)率低以及純度較低的致命缺點(diǎn)。此外，多步驟、較長(zhǎng)的工藝，使得雷沙吉蘭的合成無(wú)法高效進(jìn)行。因此，越來(lái)越多的科學(xué)家致力于研究高效綠色合成雷沙吉蘭的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種在微流場(chǎng)中以1-茚醇為起始原料，利用醇脫氫酶和還原性氨基酶合成治療帕金森藥物雷沙吉蘭的方法。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種在微流場(chǎng)合成雷沙吉蘭的方法，包括如下步驟:

3、步驟s1：將醇脫氫酶和還原性氨基酶分別固定在樹脂上，得到固定化的醇脫氫酶和固定化的還原性氨基酶；

4、步驟s2：將所述固定化的醇脫氫酶和固定化的還原性氨基酶混合均勻后填充至微通道反應(yīng)器中；

5、步驟s3：將1-茚醇、nadp+和炔丙胺的混合溶液用注射泵連續(xù)通入微通道反應(yīng)器中反應(yīng)生成雷沙吉蘭；

6、其中，所述醇脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，還原性氨基酶的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

7、所述醇脫氫酶通過(guò)如下制備方法制備得到：將基因序列如seq?id?no.3所示的醇脫氫酶lsadh基因構(gòu)建到pet-28a（+）載體上，并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌bl?21（de?3）中，培養(yǎng)并純化得到對(duì)應(yīng)的醇脫氫酶lsadh。

8、所述還原性氨基酶通過(guò)如下方法制備得到：將基因序列如seq?id?no.4所示的還原性氨基酶aspredam基因構(gòu)建到pet-28a（+）載體上，并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌bl?21（de?3）中，培養(yǎng)并純化得到對(duì)應(yīng)的還原性氨基酶aspredam。

9、步驟s1中，樹脂與醇脫氫酶或還原性氨基酶的用量比為400~1400?mg：20~70?mg。

10、所述醇脫氫酶或還原性氨基酶固定在樹脂上的方法為：將培養(yǎng)并純化得到的醇脫氫酶或還原性氨基酶分散于浸有預(yù)處理后環(huán)氧樹脂的磷酸鹽緩沖液中，于18~25℃下在160~200?rpm下持續(xù)攪拌4~8?h，用10~50?mm磷酸鹽緩沖液沖洗三遍，以去除未固定上的蛋白，抽濾漏斗抽干取出樹脂。所述lsadh和aspredam純化后分散于pbs緩沖液中，經(jīng)由樹脂吸附固定在微通道中參與反應(yīng)，可利用酶標(biāo)儀測(cè)得固定化前酶量以及固定化后上清液酶量。蛋白吸附率的計(jì)算公式為（固定化前總酶量-上清液中酶量）/固定化前總酶量。

11、優(yōu)選地，步驟s1中，所述樹脂投入使用前需先活化。活化步驟如下：首先，將1~2?g環(huán)氧樹脂懸浮于10~20?ml的改性溶液（包含0.1?m?硼酸鈉和?2?m?亞氨基二乙酸）中。然后將該混合物放入恒溫?fù)u床中，在20~30°c條件下，以180?r/min速度溫和孵育2~6?h。隨后，使用抽濾漏斗對(duì)混合物進(jìn)行過(guò)濾，以分離環(huán)氧樹脂和改性溶液。然后，樹脂用去離子水徹底沖洗，重復(fù)三次，以確保移除殘留的改性溶液。在下一步中，過(guò)濾后的環(huán)氧樹脂與10~20?ml0.5?m的硫酸溶液在相同的溫度和攪拌條件下孵育2~6?h。此步驟旨在消除殘余的環(huán)氧基團(tuán)，從而防止未來(lái)步驟中的意外反應(yīng)。孵育完成后，將樹脂通過(guò)過(guò)濾方式收集，并使用去離子水沖洗三次，目的是清除殘留的酸性物質(zhì)。在酸處理之后，環(huán)氧樹脂進(jìn)一步與10~20?ml的0.1?m高碘酸鈉溶液在20~30°c和180?r/min的條件下處理2~6?h。此步驟通過(guò)促進(jìn)環(huán)氧樹脂的氧化，引入關(guān)鍵官能團(tuán)醛基。孵育之后，樹脂進(jìn)行過(guò)濾并用去離子水沖洗三次，以去除未反應(yīng)的高碘酸鈉。隨后，將處理過(guò)的環(huán)氧樹脂與10~20?ml金屬改性溶液混合后溫和孵育2~6h，溫度20~30°c，轉(zhuǎn)速180?r/min。這一關(guān)鍵步驟旨在將金屬離子引入樹脂結(jié)構(gòu)中，增強(qiáng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合的親和力。孵育結(jié)束后，對(duì)樹脂進(jìn)行過(guò)濾，并用去離子水進(jìn)行三次沖洗，以清除未結(jié)合的金屬離子。最后一步，環(huán)氧樹脂與10~20?ml的解吸附溶液在20~30°c和180?r/min的條件下孵育2~6?h，以去除松散結(jié)合的金屬離子，確保只有緊密附著的金屬離子留存。然后，樹脂進(jìn)行過(guò)濾，用去離子水沖洗三次，并使用水泵抽濾干燥，以去除任何殘余的水分。然后將處理好的環(huán)氧樹脂轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦校⒃?°c的低溫下儲(chǔ)存，直到進(jìn)一步使用。

12、其中，所述1-茚醇、nadp+和炔丙胺的混合溶液的反應(yīng)溶劑為pbs緩沖液與有機(jī)溶劑的混合物，所述有機(jī)溶劑為正庚烷、異辛烷、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二甲基亞砜中的任意一種或幾種；其中，有機(jī)溶劑的體積小于等于反應(yīng)溶劑總體積的百分之一。

13、步驟s1，所述樹脂為疏水性的環(huán)氧基樹脂es-1、es-103b、es-108、lx-1000ep、nka和esd-1中的任意一種。

14、具體地，1-茚醇的濃度為5~20?mm，nadp+濃度為2~5?mm，炔丙胺的濃度為25~100mm。

15、所述微通道反應(yīng)裝置中的管道為聚四氟乙烯管，長(zhǎng)度為30~50?cm，直徑為2~3?mm。

16、優(yōu)選地，微通道反應(yīng)條件為：在25~30℃下、停留時(shí)間為15~60?min。

17、綜上所述，本發(fā)明公開了一種在微流場(chǎng)中通過(guò)醇脫氫酶與還原性氨基酶協(xié)同催化生成雷沙吉蘭的方法。該方法基于雙酶借氫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將外消旋醇高效轉(zhuǎn)化為對(duì)映體胺，實(shí)現(xiàn)手性胺的直接合成，具有較高的原子經(jīng)濟(jì)性和反應(yīng)效率。本發(fā)明采用固定化酶的雙酶協(xié)同催化策略，通過(guò)微通道反應(yīng)裝置，以1-茚醇為原料，利用醇脫氫酶催化的氧化反應(yīng)和還原性氨基酶催化的還原胺化反應(yīng)，成功制備高純度雷沙吉蘭。該方法具有反應(yīng)條件溫和、綠色可持續(xù)、產(chǎn)物收率高、反應(yīng)快速及光學(xué)純度高等優(yōu)勢(shì)，為雷沙吉蘭的合成提供了一種高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的新途徑。

18、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)：

19、（1）本發(fā)明首次在微流場(chǎng)中，通過(guò)固定化醇脫氫酶和還原性氨基酶，兩步酶組合催化，將1-茚醇去消旋化，得到利用化學(xué)方法難以合成的雷沙吉蘭，該方法避免了昂貴的原料、高溫、污染嚴(yán)重的制備方法，操作簡(jiǎn)單，光學(xué)純度高、選擇性好、反應(yīng)條件溫和、可持續(xù)性強(qiáng)、產(chǎn)物收率高、安全性高、反應(yīng)快速，更符合綠色化學(xué)的要求；

20、（2）本發(fā)明基于雙酶借氫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，采用固定化酶的雙酶協(xié)同催化策略將外消旋醇高效轉(zhuǎn)化為對(duì)映體胺，實(shí)現(xiàn)手性胺的直接合成，具有較高的原子經(jīng)濟(jì)性和反應(yīng)效率；

21、（3）本發(fā)明采用固定化純酶的方法，成功進(jìn)行還原性氨基酶與醇脫氫酶的固定，最終填充固定于微通道反應(yīng)器中，可以保存在4℃下，便于重復(fù)使用。