一種抗氧化多肽aop-om1及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物技術領域，具體涉及一種抗氧化多肽AOP-OMl及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]抗氧化劑是阻止氧氣不良影響的物質，它是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對人體損害的一類物質。目前已經發(fā)現了大量的抗氧化劑，這些抗氧化劑可以被分為以下兩大類:1)非基因編碼的小分子無助，如維生素E、維生素C、谷胱甘肽等；2)基因編碼的大分子物質，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、硫氧還蛋白等。這些抗氧化劑已經被廣泛應用于各種領域，包括健康、食品、化妝品及各種工業(yè)中，比如作為燃料和潤滑劑的穩(wěn)定劑防止氧化，也可加在汽油中起到防止聚合從而避免引擎積垢形成的目的，單在2007年，工業(yè)用途的抗氧化劑的就創(chuàng)造了大約37億美元的收入?；诳寡趸瘎┑闹匾?，科學家們一直在孜孜不倦的尋找著新型抗氧化劑。
[0003]兩棲動物是水生動物過度到陸生動物之間的重要類群，其皮膚裸露，表面沒有毛發(fā)覆蓋，直接面對各種生存壓力，承當著諸多重要的生物學功能，比如抵御微生物入侵、體色調節(jié)、水鹽平衡調節(jié)等。已經有大量的研宄證據表明，兩棲動物的皮膚能分泌大量的活性物質(主要是蛋白和多肽)使得其能完成這些重要的生物學功能。但因藥材來源等特殊性，其效應物質基礎與作用機制的研宄還較為薄弱，關于其活性成分的報道幾乎為零。因此，如何充分利用現代生物技術手段，分離純化活性多肽并進行結構鑒定，深入開展研宄藥材效應物質基礎與作用機制研宄，是該領域科研技術人員多年來努力尋求突破的研宄方向之
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【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的第一目的在于提供一種抗氧化多肽A0P-0M1 ;第二目的在于提供所述的抗氧化多肽A0P-0M1的制備方法；第三目的在于提供所述的抗氧化多肽A0P-0M1的應用。
[0005]本發(fā)明的第一目的是這樣實現的，所述的抗氧化多肽A0P-0M1的氨基酸序列如SEQ ID:N0.1 所示。
[0006]本發(fā)明的第二目的是這樣實現的，包括以下步驟:
A、取原料大綠臭娃皮膚分泌物lOOmg，加入Iml去離子水溶解，上SephadexG-75柱，用Tris-HCl緩沖液以流速1.5ml/min進行洗脫，每1min收集一次，分別測定洗脫液在280nm下的吸光度，收集合并活性峰值組分的洗脫液，濃縮干燥后得到浸膏a ;
B、Img浸膏a中加入Iml去離子水溶解，上Hypersil0DS2色譜柱，用乙腈以lml/min流速進行洗脫，監(jiān)測215nm下的吸光度，收集合并活性峰值組分的洗脫液，濃縮干燥后得到目標物。
[0007]以上述分離純化方法制備得到的抗氧化多肽A0P-0M1的結構式通過以下方法鑒定出來的: 1、氨基酸序列的測定:
純化得到的大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-AMl在全自動蛋白質序列測定儀(島津PPSQ-31A)上經Edman降解法，測定了大綠臭娃皮膚抗氧化肽AOP-AMl氨基酸全序列，結果表明大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-AMl具有本發(fā)明SEQ ID NO:1所示的結構。
[0008]2、質譜分子量測定:
基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALD1-T0F-MS)檢測了純化得到的大綠臭蛙皮膚抗氧化肽A0P-0M1的精確分子量，所用儀器為Bruker公司Autoflex III T0F/T0F質譜儀。大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-AMl質譜測定的分子量分別為938.1道爾頓，質譜結果揭示大綠臭蛙皮膚抗氧化肽A0P-0M1不存在翻譯后修飾。
[0009]本發(fā)明的第三目的是這樣實現的，所述的抗氧化多肽A0P-0M1在制備抗氧化藥物中的用途。
[0010]本發(fā)明是在兩棲動物滇蛙的皮膚中發(fā)現了一類新型的抗氧化劑，其化學本質為多肽，和傳統的兩大類抗氧化劑不同，其由基因編碼，但分子量卻很小。此后，在一些兩棲動物皮膚中也發(fā)現了這一類物質，但和傳統的抗氧化劑相比，我們對這一類新型抗氧化劑的結構和功能了解還知之甚少。大綠臭蛙是中國特有的一種臭蛙，廣泛分布于強紫外照射的云貴高原，根據其生境，我們推測其皮膚能分泌高效的抗氧化劑使得其能抵御紫外照射所造成的傷害。本發(fā)明從中國產大綠臭蛙的皮膚中得到了 I個新穎的抗氧化多肽A0P-0M1，其抗氧化活性很強，約為維生素E的200倍。
【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明大綠臭蛙皮膚抗氧化肽A0P-0M1的G-75分子篩層析圖；
圖2為本發(fā)明大綠臭蛙皮膚抗氧化肽A0P-0M1的HPLC反相C18柱層析圖；
圖3為本發(fā)明分離純化天然大綠臭蛙皮膚抗氧化肽A0P-0M1的質譜圖；
圖4為本發(fā)明分離純化大綠臭蛙皮膚抗氧化肽A0P-0M1的自由基ABTS+清除活性圖。
【具體實施方式】
[0012]下面結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0013]本發(fā)明所述的抗氧化多肽A0P-0M1的氨基酸序列如SEQ ID:N0.1所示。
[0014]本發(fā)明所述的抗氧化多肽A0P-0M1的制備方法，包括以下步驟:
A、取原料大綠臭娃皮膚分泌物lOOmg，加入Iml的去離子水溶解，上SephadexG-75柱，用Tris-HCl緩沖液以流速1.5ml/min進行洗脫，每1min收集一次，分別測定洗脫液在280 nm下的吸光度，收集合并活性峰值組分的洗脫液，濃縮干燥后得到浸膏a ;
B、取浸膏aI mg，加入Iml去離子水溶解，上Hypersil 0DS2色譜柱，用乙腈以lml/min進行洗脫，監(jiān)測215nm下的吸光度，收集合并活性峰值組分的洗脫液，濃縮干燥后得到目標物。
[0015]A步驟中所述的S印hadex G-75柱需預先用20 mmol/L，pH7.8的Tris-HCl緩沖液平衡24h。
[0016]B步驟中所述的Hypersil 0DS2色譜柱需預先用含0.1%三氟乙酸的超純水平衡20 min0
[0017]B步驟中所述的乙腈為含0.1%三氟乙酸的乙腈。
[0018]B步驟中所述的洗脫是在線性梯度洗脫，即乙腈濃度從0%升至100%所花的時間為100 min0
[0019]本發(fā)明的應用為所述的抗氧化多肽AOP-OMl在制備抗氧化藥物中的用途。
[0020]本發(fā)明提供的大綠臭蛙皮膚抗氧