針對赭曲霉毒素a的抗原模擬表位及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及赭曲霉毒素A抗原模擬表位及其應用。
【背景技術】
[0002]赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, 0ΤΑ)是一種常見的真菌毒素，是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產生的次級代謝產物。研究表明OTA易蓄積于組織中，其作用的主要靶器官是腎臟、肝臟，屬烈性的腎臟和肝臟毒素，實驗表明動物攝入被這種毒素污染的飼料后，會發(fā)生急性或慢性中毒癥。此外，據文獻報導，OTA還具有致癌、致畸和致突變性。OTA的產毒菌株廣泛地存在于自然界中，在各種農作物、食品、飼料和人類及動物的組織、血液中都能檢測到OTA的污染。對OTA污染進行及時檢測是預防和控制其危害的有效手段。
[0003]目前，檢測食品中OTA的方法主要有高效液相色譜、氣相色譜、薄層色譜及免疫學檢測等方法，免疫學檢測方法以其靈敏度高、檢測方便、成本低廉等優(yōu)勢在OTA的檢測中得到了廣泛的應用。然而，在建立免疫學檢測方法的過程中，必須使用OTA標準品為原料來制備競爭抗原或者固相包被抗原，OTA不僅價格昂貴而且具有極強的致癌性，對檢測人員的健康和環(huán)境造成極大的威脅，從而在一定程度上制約了免疫學檢測方法的應用和推廣。有鑒于此，人們開始采用抗獨特型抗體及抗原模擬表位技術來實現(xiàn)有害小分子物質標準品的替代，并取得了一定的進展。噬菌體展示肽庫技術的主要特點是可有效地篩選出與目標靶體特異結合的噬菌體展示多肽，該技術在探索受體與配體之間相互作用結合位點、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質空間結構表位、新型疫苗的研制等方面應用廣泛。
[0004]本發(fā)明通過用噬菌體展示肽庫技術，從肽庫中篩選出能與靶分子(抗OTA單克隆抗體)特異性結合的多肽(抗原模擬表位)，該抗原模擬表位具有與天然OTA分子相似的免疫反應特性，通過獲得的OTA抗原模擬表位，以代替價格昂貴且毒性強的OTA標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于OTA的免疫學檢測。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明以抗OTA單克隆抗體為靶分子，將靶分子固相包被于酶標板上，投入噬菌體隨機展示十二肽庫，進行親和淘選，獲得了四種OTA的抗原模擬表位。它們的氨基酸序列如下:KLGFQLHQPSWP、FNLHQPIHNWPL、AQFFQLHSQAYS 或 DGFQLHTPFSAK。
[0006]本發(fā)明還涉及編碼上述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列，分別對應為: AAGCTTGGGTTTCAGTTGCATCAGCCTAGTTGGCCG、TTTAATTTGCATCAGCCGATTCATAATTGGCCGC
TG、GCTCAGTTTTTTTAGCTGCATTCGCAGGCGTATTCG、GATGGTTTTCAGTTGCATACTCCTTTTTCTGCTAAG上述抗原模擬表位(多肽)結構中，大寫英文字母分別代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構體的一種，即C代表半胱氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，F(xiàn)代表苯丙氨酸殘基，E代表谷氨酸殘基，M代表甲硫氨酸殘基，G代表甘氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，Q代表谷氨酰胺殘基，W代表色氨酸殘基，N代表天冬酰胺殘基，A代表丙氨酸殘基，T代表蘇氨酸殘基。
[0007]本發(fā)明提及的OTA抗原模擬表位(多肽)可通過噬菌體擴增、化學合成或基因工程重組表達的方式進行大量制備。噬菌體擴增是指將展示有OTA抗原模擬表位(多肽)的噬菌體，通過生物擴增的方式，大量繁殖生產展示有OTA抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子。化學合成是指依據OTA抗原模擬表位的氨基酸序列，通過化學合成多肽的方式進行多肽合成?；蚬こ讨亟M表達的方式是指將編碼OTA抗原模擬表位的基因，通過克隆至表達載體，以多肽-融合蛋白的形式進行OTA抗原模擬表位的大量制備。
[0008]本發(fā)明還涉及所述OTA抗原模擬表位在免疫學檢測分析中的應用。免疫學檢測的類型包括酶聯(lián)免疫吸附檢測、膠體金免疫層析、免疫斑點雜交等基于抗原-抗體特異性反應的免疫學分析檢測類型。
[0009]本發(fā)明OTA 抗原模擬表位(KLGFQLHQPSWP、FNLHQPIHNWPL、AQFFQLHSQAYS 或DGFQLHTPFSAK)在應用時，可以把合成的模擬表位用于免疫學檢測分析，將通過噬菌體擴增獲得的展示有OTA抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子直接用于分析檢測，當然，也可以將OTA抗原模擬表位從噬菌體上切下來代替OTA標準品來進行免疫學檢測分析。
[0010]還涉及OTA抗原模擬表位以固相抗原或競爭抗原在免疫學檢測分析中的應用。
[0011]還涉及OTA抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測分析中的應用。
[0012]前述OTA抗原模擬表位可以替換價格昂貴且毒性強的OTA標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于OTA的免疫學檢測，該抗原模擬表位具有與天然OTA分子相似的免疫反應特性，效果非常好。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明OTA抗原模擬表位可以替換價格昂貴且毒性強的OTA標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于OTA的免疫學檢測，該抗原模擬表位具有與天然OTA分子相似的免疫反應特性，效果非常好。減少了 OTA對人體健康的危害，節(jié)約了成本，具有很高的應用價值。
【附圖說明】
[0014]圖1以OTA抗原模擬表位建立的間接競爭ELISA標準曲線。OTA抗原模擬表位Ph-1 (KLGFQLHQPSWP)、Ph-7 (FNLHQPIHNWPL)、Ph-18 (AQFFQLHSQAYS)、Ph_5 (DGFQLHTPFSAK)與抗 OTA 抗體的 ICjt分別為 553，495，509 pg/ml 和 1.03 ng/ml。
【具體實施方式】
[0015]實施例1.0TA抗原模擬表位的親和淘選及其鑒定
I )0ΤΑ抗原模擬表位的親和淘選:具體方法為:用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗OTA單克隆抗體，并以終濃度100 yg/mL包被96孔酶標板，4°C孵育過夜。第二天用TBST (50mM NaCl, pH 7.5 包含 0.1% Tween-20 (v/v))洗滌 10 次后，加入 300 μ I 封閉液(3%BSA-PBS) 4°C孵育2小時。2小時后棄封閉液，用TBST洗滌5次，每孔加入100 μ I噬菌體肽庫(噬菌體展示十二肽庫，購自NEB公司，用TBS 10倍稀釋噬菌體原液，約1.0X 111Pfu)，22-26°C振蕩反應I小時。棄去未結合的噬菌體，用TBST洗滌10次，結合上的噬菌體用 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2)洗脫，并立即用 15 μ I I M Tris-HCl (pH 9.1)中和。取10 μ I洗脫噬菌體測滴度，其余的用于感染20 mL生長至對數(shù)前期的Ε.coli ER2738菌株進行擴增。第三天用PEG/NaCl沉淀純化噬菌體，并測定擴增后噬菌體的滴度。
[0016]在第二、第三輪的淘選過程中，包被的抗OTA單克隆抗體濃度分別為75 yg/mL和50 μ g/mL,所用的TBST濃度為0.25%和0.5%，其余步驟同上。
[0017]2)陽性噬菌體克隆的鑒定:從第三輪淘選后測定噬菌體滴度的平板中隨機挑取20個曬菌體斑,進行曬菌體的擴增,采用間接酶聯(lián)免疫吸附檢測方法(Indirect EnzymeLinked immunoasorbent assay, 1-ELISA)進行陽性曬菌體克隆的鑒定,具體方法為:首先，用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗OTA單克隆抗體，10 Pg/mL包被96孔酶標板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37°C孵育I小時；投入100 μ?噬菌體斑擴增液(1.0 X 111 pfu)，以原始噬菌體肽庫作為陰性對照，37 °C孵育I小時；加入1:5000倍稀釋的HRP標記抗M13噬菌體二抗100 μ1，37 °C孵育I小時；加入ΙΟΟμΙ TMB底物液，避光顯色5min，酶標儀(ThermoScientific Multiskan FC)讀取450 nm處的吸收值。選取OD45c!大于陰性對照2倍的卩遼菌體克隆為陽性克隆。
[0018]3) OTA抗原模擬表位的鑒定:采用間接競爭ELISA的方法進行OTA抗原模擬表位的鑒定，具體方法為:用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗OTA單克隆抗體，10 Pg/mL包被酶標板，4°C孵育過夜；第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37°C孵育I小時；投入50 μ?經間接ELISA鑒定為陽性的噬菌體克隆(1.0XlO11 pfu)和50 μ? OTA標準品(濃度范圍為0_20 ng/ml)，37°C孵育I小時；加入1:5000稀釋HRP標記的抗M13噬菌體二抗100 μ1，37?孵育I小時；加入ΙΟΟμΙTMB底物液，避光顯色5min，讀取OD45tl,能結合抗OTA單克隆抗體，且能被OTA標準品所阻斷的噬菌體，鑒定為OTA的抗原模擬表位。
[0019]實施例2.0TA抗原模擬表位編碼基因的測序及其氨基酸序列的確定
將經過間接競爭ELISA鑒定展示有OTA抗原模擬表位的噬菌體進行擴增，提取噬菌體的DNA測序模板。簡要過程如下:進行噬菌體擴增，在第一步離心后，將800 μ?含噬菌體上清轉入一新離心管。加入200 μ? PEG/NaCl沉淀噬菌體。離心后將沉淀重懸于100 μ?碘化物緩沖液(10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，I mM EDTA, 4 M NaI)，加入 250 μ? 無水乙醇沉淀DNA，離心后再用70%乙醇洗滌沉淀(DNA測序模板)。沉淀最終重懸于20 μ?滅菌水，取2μ?進行瓊脂糖凝膠電泳分析；取5 PL噬菌體模板進行DNA測序，其-96 gill測序引物為:5’-hqCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG_3’。依據DNA測序結果及密碼子表可獲得OTA抗原模擬表位的氨基酸序列。它們的氨基酸序列如下:KLGFQLHQPSWP、FNLHQPIHNWPL、AQFFQLHSQAYS或 DGFQLHTPFSAK。
[0020]實施例3.0TA抗原模擬表位作為競爭抗原在ELISA中的應用 (I)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關食品)，加入25毫升60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號濾紙進行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，PH=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0021](2)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗OTA單克隆抗體，10 Pg/mL包被酶標板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37 °C孵育I小時后，用PBST洗板6次待用。
[0022]( 3 )標準曲線的建立
取出經步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ?展示有OTA抗原模