一種診斷結(jié)核病的特異性抗原蛋白及其在制備診斷試劑盒中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于結(jié)核病診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種診斷結(jié)核病的特異性 抗原蛋白及其在制備診斷試劑盒中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核分枝桿菌是對人類健康威脅最大的病原體之一，結(jié)核病是當(dāng)今世界上成 年人中的主要傳染病，已對國際公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴峻挑戰(zhàn)（[l]Khasnobis S. ,Escuyer V. E. , Chatterjee D. Emerging therapeutic targets in tuberculosis:post-genomic era. Exper Opin.Ther. Targets, 2002, 6:21 ?40)。據(jù) WHO 報告：全球己受到結(jié)核菌感染 者約20億人，現(xiàn)有肺結(jié)核病人約2000萬，每年新發(fā)病例800?1000萬，每年死于結(jié)核病約 300萬，相當(dāng)于每10秒鐘就有一個人死于結(jié)核病。結(jié)核菌在感染人體以后，多處于潛伏狀態(tài) 或持續(xù)感染狀態(tài)，它能在感染宿主細胞內(nèi)逃避宿主的防御作用而大量繁殖并和宿主達到一 種微妙的平衡，感染者一生中的任何時候都有可能發(fā)病。一般情況下，10%的感染者將發(fā)展 為活動性肺結(jié)核。一個未經(jīng)治療的活動性肺結(jié)核病人，一年能傳染10?15人。
[0003] 回顧近五十年來全球結(jié)核病斗爭歷程，結(jié)核病的控制理論與技術(shù)、臨床診斷治療 水平與研宄均有長足的進步。由于有效化療藥物（異煙肼、利福平、吡嗪酰銨、鏈霉素、乙胺 丁醇等）的普遍應(yīng)用和卡介苗在世界范圍的推廣，使得結(jié)核病的發(fā)病率曾一度降低，以至 于人們樂觀地認為，結(jié)核病將同天花一樣被人類徹底消滅。但在八十年代中期，由于過分樂 觀的估計形勢，減少投資、縮減機構(gòu)，放松對結(jié)核病的治療與管理，結(jié)核病又在許多國家死 灰復(fù)燃，發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)再次回升。1993年WHO宣布結(jié)核病處于"全球緊急狀態(tài)"，并 呼吁"迅速采取行動與結(jié)核病危機進行斗爭"，這在WHO歷史上發(fā)表這樣的聲明尚屬首次。
[0004] 值得注意的是，全球90%的結(jié)核病病人在發(fā)展中國家。世界性的艾滋病流行不僅 增加結(jié)核病內(nèi)源性復(fù)燃的發(fā)病機會，也增加了外源性再感染的危險，加速了結(jié)核病疫情的 惡化。據(jù)WHO流行病學(xué)報告：結(jié)核病是HIV(+)者的第一殺手（32%)。耐藥及耐多藥結(jié)核 病也已成為當(dāng)前結(jié)核病控制工作中的重大威脅。中國是世界上結(jié)核病疫情負擔(dān)最重的22 個國家之一，結(jié)核病人數(shù)僅次于印度而居世界第二，屬于高流行地區(qū)，疫情呈"三高一低"， 即患病率高（523/10萬）、死亡率高（20. 9/10萬），耐藥率高（原發(fā)耐藥率28. 1 %，獲得耐 藥率41. 1%)、年遞降率低（肺結(jié)核患病率年遞降率2. 8%)。2000年第四次全國結(jié)核病流 行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果表明，我國有5. 5億人感染了結(jié)核菌，現(xiàn)有肺結(jié)核病人450萬，其中傳 染性肺結(jié)核病人200萬。2005年估計有結(jié)核病患者500萬人，其中80%的患者在農(nóng)村。我 國每年死于結(jié)核病的人數(shù)為死于其它各類傳染病人數(shù)總和的2倍以上，是中國十大致死疾 病之一。因此，有效的預(yù)防和控制結(jié)核病的發(fā)生，以及針對既有結(jié)核病的治療就顯得尤其緊 迫，刻不容緩。
[0005] 結(jié)核病的預(yù)防：WH0已將卡介苗（BCG)列入擴大免疫計劃范疇。然而，針對肺結(jié)核 的免疫保護作用的報道差異甚大，從〇?80%不等。另外，隨著HIV感染的流行，已有報告 AIDS病人接種BCG后引起全身播散性感染。
[0006] 結(jié)核病的治療：到目前為止結(jié)核病的治療方法是抗生素菌治療，是以細菌學(xué)為基 礎(chǔ)的?；瘜W(xué)治療不僅是治療和控制疾病的有力手段，而且也是結(jié)核病防治規(guī)劃的重要組成 部分。成功的化學(xué)治療與管理，將會帶來疫情的改善，包括感染率、患病率及死亡率的下降。 然而，盡管這些抗結(jié)核藥物能發(fā)揮一定的治療效果，但是隨之帶來的副作用也是不容忽視 的，耐藥、多重耐藥超耐藥菌株不斷出現(xiàn)，新藥研發(fā)的速度遠遠低于耐藥的產(chǎn)生的速度。徹 底根除結(jié)核桿菌是世界難題。
[0007] 結(jié)核病毒診斷：主要有以下幾種方法：
[0008] (一）痰菌檢查：1、痰涂菌檢查，痰結(jié)核菌檢查簡便易行，準(zhǔn)確性較高，痰中查出結(jié) 核菌，就能確診患了結(jié)核病。一般初次就診要查三個痰標(biāo)本，即夜間痰、清晨痰和即時痰。它 雖然是診斷肺結(jié)核"金指標(biāo)"但診斷率低，培養(yǎng)周期長。2、痰結(jié)核菌培養(yǎng)，結(jié)果可信度高，并 能做結(jié)核菌藥敏試驗，但需時6-8周，應(yīng)用受到限制。
[0009] (二）X射線檢查：胸部X線檢查可以早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病，而且可以確定病灶的部 位、性質(zhì)、范圍，了解發(fā)病情況及用于治療效果的判斷，并且開展方便，病人樂于接受。胸部 CT可以發(fā)現(xiàn)較小的或隱蔽部位的病變，可以彌補一般X線檢查的不足。但容易與其他肺部 疾病混淆，需要專業(yè)醫(yī)生確證。
[0010] (三）肺結(jié)核病免疫學(xué)診斷：1·常用的有結(jié)核菌素純蛋白衍化物（PPD)試驗，該試 驗陽性是感染過結(jié)核菌的證據(jù)之一。假陽性率高，容易誤診。2.血中、痰中結(jié)核抗體檢測陽 性也有助于診斷，如38kDa及其許多包含38kDa抗原在內(nèi)的融合蛋白抗原，用于體液免疫方 面的診斷，但也不可避免的出現(xiàn)假陽性率。3. BACTEC法測結(jié)核分枝桿菌的代謝物，一般兩周 可分離出分枝桿菌，但菌量多少能影響陽性結(jié)果出現(xiàn)的天數(shù)。5.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)，特異 性較差，優(yōu)點是敏感性可達98%?100%。
[0011](四）其他檢查，只能作為輔助診斷，不能作為診斷依據(jù)。1.纖維支氣管鏡檢查： 可以直接觀察或間接判斷支氣管、肺內(nèi)病變，并且有活組織檢查、灌洗、錄像、拍攝氣管內(nèi)照 片等功能，對于診斷和鑒別診斷特別有用。2.胸腔鏡和縱隔鏡檢查：均可用于觀察胸腔、縱 隔內(nèi)腫大淋巴結(jié)，并可取出活組織檢查以利診斷和鑒別診斷。3.超聲波檢查：主要用于胸 腔積液的診斷和鑒別診斷。
[0012] 在常用的肺結(jié)核診斷技術(shù)中存在著陽性率低、周期長、操作復(fù)雜、假陽性率高等問 題，因此迫切需要需要一種快速、簡便、敏感、特異的診斷方法，以快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病。
[0013] 值得注意的是，結(jié)核分枝桿菌感染人體后，首先會被人體的免疫系統(tǒng)識別，激活機 體的T細胞免疫應(yīng)答，分泌產(chǎn)生IFN- γ，后者發(fā)揮抗結(jié)核感染作用。部分T細胞轉(zhuǎn)化為免疫 記憶細胞，當(dāng)再次與結(jié)核桿菌相遇后，會再次分泌產(chǎn)生IFN- γ，發(fā)揮抗結(jié)核感染作用?？乖?特異的IFN-γ產(chǎn)生量與機體是否感染或發(fā)病密切相關(guān)。因此，如果采用結(jié)核桿菌特異的抗 原在體外刺激感染者和患者的T細胞，可誘導(dǎo)這些T細胞產(chǎn)生高水平的結(jié)核桿茼抗原特異 的IFN-γ，而非結(jié)核桿菌感染者或非結(jié)核病患者產(chǎn)生的IFN-γ的量與未用抗原刺激產(chǎn)生 的量相近，從而實現(xiàn)診斷的目的。由此可見，尋找并發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌特異性抗原，對發(fā)展新一 代的診斷試劑具有重要價值和意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 針對現(xiàn)有診斷方法的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種敏感性和特異性高的 結(jié)核病診斷抗原蛋白，該抗原蛋白可實現(xiàn)對結(jié)核病病人或早期感染者的快速、特異的診斷， 在阻斷結(jié)核病的傳播和流行，以及對結(jié)核病的控制具有重大意義。
[0015] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，發(fā)明人通過大量試驗研宄和不懈努力，最終獲得如 下技術(shù)方案：
[0016] -種診斷結(jié)核病的特異性抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或者是該 序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
[0017] 另外，本發(fā)明也提供了編碼上述特異性抗原蛋白的DNA分子。優(yōu)選地，該DNA分子 的核苷酸序列為