一種鄰苯二甲酸酯類化合物通用人工抗原的合成方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及人工抗原，具體指一種鄰苯二甲酸酯類化合物通用人工抗原的合成方 法，屬于生物化工技術領域。
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【背景技術】
[0003] 鄰苯二甲酸醋類化合物（phthalate esters, PAEs)又名酞酸醋，是鄰苯二甲酸的 酯化衍生物，為一類常用增塑劑，可提高塑料制品的塑性和強度。PAEs為無色油狀粘稠液 體，易溶于有機溶劑和類酯，難溶于水，不易揮發(fā)。在塑料制品中增塑劑與塑料分子的相溶 性較好，兩者間沒有嚴密的化學結合鍵，而是由氫鍵或范德華力連接，彼此保持各自獨立的 化學性質。PAEs是一類環(huán)境內分泌干擾物質，含有較弱的雌激素成分，可通過呼吸、攝食和 皮膚接觸進入動物和人體內，具有致突變、致畸和癌細胞增殖等危害。
[0004] 目前，國內外檢測PAEs的主要方法有高效液相色譜法（HPLC)、氣相色譜-質譜法 (GC-MS)、液相色譜-質譜法（LC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)等。儀器分析法的樣品前 處理步驟復雜、操作繁瑣，導致檢測成本高、周期長，無法滿足批量樣品的快速篩選和現(xiàn)場 檢測的實際需要。ELISA法屬于免疫分析技術，具有較高的靈敏度和特異性，檢測時對樣品 的純度要求低，操作簡便、快捷，在現(xiàn)場篩選和大量樣本的快速檢測中具有獨特的優(yōu)勢。
[0005] PAEs不能直接作為抗原與抗體產(chǎn)生特異性反應，發(fā)展免疫分析技術的關鍵在于制 備能誘導動物產(chǎn)生特定抗體的人工抗原。目前，最常見的方法是在鄰苯二甲酸酯的苯環(huán)上 引入活性氨基，再通過重氮法或戊二醛法與載體蛋白偶聯(lián)，暴露出PAEs的側鏈基團為抗原 決定簇，免疫動物獲得完全抗原。但是，這些方法獲得的抗原只與特定PAEs產(chǎn)生較好的抑 制效果，交叉反應率較低，得到的抗體無法應用于PAEs的通用檢測。
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【發(fā)明內容】

[0007] 針對目前PAEs抗原合成技術的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種PAEs通 用人工抗原的合成方法，本方法合成的抗原能夠制備出通用的、廣譜的、可用于多種PAEs 檢測的多克隆抗體。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下： 一種鄰苯二甲酸酯類化合物通用人工抗原的合成方法，以4-硝基鄰苯二甲酸為原料， 經(jīng)過酯化、還原和酰胺化反應合成鄰苯二甲酸酯類化合物通用半抗原，再將鄰苯二甲酸酯 類化合物通用半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)，即得到所述的鄰苯二甲酸酯類化合物通用人工 抗原。
[0009] 其中，以4-硝基鄰苯二甲酸合成鄰苯二甲酸酯類化合物通用半抗原的步驟如下， ①在反應瓶中加入甲醇30 mL，冰浴冷卻，用恒壓滴液漏斗滴加9.52 g SOCl2，撤去冰 浴，在室溫下攪拌1小時，加入4.32 g 4-硝基鄰苯二甲酸，轉入70°C油浴加熱回流；反應 完畢，于50°C水浴旋蒸近干，加入20 mL乙酸乙酯和10 mL蒸餾水，用飽和NaHC03溶液調節(jié) pH至7~8, 30 mL乙酸乙酯分3次萃取，每次10 mL，合并有機相，無水Na2SO4干燥，旋蒸，得 到淡黃色粉末狀固體，該淡黃色粉末狀固體為4-硝基鄰苯二甲酸二甲酯； ② 在反應瓶中加入3.35 g 4-硝基鄰苯二甲酸二甲酯、7.29 g鋅粉、1.498 g NH4C1、 甲醇30 mL，75°C恒溫水浴回流反應，薄層色譜TLC監(jiān)測至反應結束；趁熱抽濾，除去鋅粉， 減壓蒸餾去溶劑，加入10 mL蒸餾水，30 mL乙酸乙酯分3次萃取，每次10 mL，合并有機相， 無水Na2SO4干燥，旋蒸，加入石油醚和乙酸乙酯按體積比1:8構成的混合溶劑，攪拌，析出固 體，抽濾，得到橘黃色粉末狀固體，該橘黃色粉末狀固體為4-氨基鄰苯二甲酸二甲酯； ③ 在4-氧代戊酰氯中加入適量干燥的二氯甲烷，攪拌溶解，加入0.201 g 4-氨基鄰 苯二甲酸二甲酯，溶解，用恒壓滴液漏斗緩慢滴加至反應瓶，再加入〇. 304 g三乙胺，室溫下 攪拌，TLC監(jiān)測反應進程；反應完畢，加入10 mL蒸餾水，30 mL乙酸乙酯分3次萃取，合并 有機相，無水Na2SO4干燥，旋蒸，得到粗產(chǎn)品；用乙酸乙酯重結晶，得到產(chǎn)物A，產(chǎn)物A命名為 4_ (4-氧代戊酰胺基）鄰苯二甲酸甲酯； ④ 在反應瓶中加入0.131 g羧甲基羥胺半鹽酸鹽、2. 5 mL吡啶和2. 5 mL甲醇，完全溶 解后，再加入0. 153 g產(chǎn)物A，室溫下攪拌，TLC監(jiān)測反應進程；反應完畢，旋蒸去溶劑，加入 10 mL蒸餾水，用稀HCl調節(jié)pH至6~7,合并有機相，無水Na2SO4干燥，旋蒸，得到黃色油狀 物，該黃色油狀物即為鄰苯二甲酸酯類化合物通用半抗原。
[0010] 以鄰苯二甲酸酯類化合物通用半抗原與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)得到鄰苯二甲酸 酯類化合物通用人工抗原的過程為， 稱取I mmol鄰苯二甲酸醋類化合物通用半抗原，溶于4 mL N, N-二甲基甲酰胺DMF， 加入2 mmol N-輕基丁二酰亞胺NHS、2 mmol二環(huán)己基碳二亞胺DCCI的鹽酸鹽，在室溫下 磁力攪拌反應24 h;反應完畢，3000 r/min離心分離10 min，棄去沉淀，上清液為反應液I ; 另取79 mg BSA溶于pH 7. 4的7 mL磷酸鹽緩沖液PBS中，此為反應液II ;在室溫條件下， 將反應液I緩慢滴加到反應液II中，4°C磁力攪拌反應過夜；次日將反應液置于經(jīng)處理的透 析袋內，PBS中透析3天，除去小分子成分，初步純化偶聯(lián)蛋白，冷凍干燥，分裝，在-20°C保 存?zhèn)溆谩?br>[0011] 相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有如下有益效果： 用本發(fā)明合成的抗原免疫新西蘭大白兔，獲得的抗血清效價為25600,對鄰苯二甲酸 二甲酯（DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP)、鄰苯二甲酸二正辛酯 (DnOP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP)、鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP)、鄰苯二甲酸 二壬酯（DNP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（DCHP)的半數(shù)抑制濃度（IC 5tl)范圍為17. 12~102. 57 ng/mL，檢測限（LOD)為0. 012~0. 042 ng/mL，獲得的抗體與其它7種PAEs的交叉反應率為 16. 69%~83. 84% (DMP為100%)。采用本發(fā)明，制備了能夠同時識別8種PAEs的廣譜特異性 抗體，抗體的通用性好、靈敏度高。本發(fā)明獲得的抗原和抗體可用于發(fā)展酶聯(lián)免疫吸附和生 物傳感分析技術，并應用于實際環(huán)境中多種PAEs的快速靈敏檢測。
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【附圖說明】
[0013] 圖1-本發(fā)明PAEs通用抗原的合成路線圖。
[0014] 圖2-PAEs通用人工抗原的紫外掃描圖譜。
[0015] 圖3-抗體的效價曲線圖。
[0016] 圖4-抗體的方陣滴定圖。
[0017] 圖5-DMP的標準競爭抑制曲線。
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【具體實施方式】
[0019] 目前，國內外主要集中在針對單一 PAEs的人工抗原合成與抗體制備研宄，未見可 檢測多種PAEs的全抗原合成與抗體制備的報道。本發(fā)明根據(jù)PAEs的結構特點，旨在改進 半抗原的合成路線，以4-硝基鄰苯二甲酸為原料，經(jīng)過酯化、還原和酰胺化反應，合