00截流量透析袋透析48h，過濾，冷凍干燥得到含疊氮基團(tuán)的直鏈淀粉，產(chǎn)率85 %。
[0038]實施例2
[0039]將0.48g干燥直鏈淀粉與4mL 1-疊氮-環(huán)氧丙烷混合溶于20mL氫氧化鈉水溶液(每100毫升水中加入0.8克氫氧化鈉形成的氫氧化鈉水溶液)中，在40°C條件下避光攪拌36h ;反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物透析72h，過濾，冷凍干燥得到含疊氮基團(tuán)的直鏈淀粉，產(chǎn)率 81%。
[0040]實施例3
[0041]將0.50g 3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸與50mg實施例1所得含疊氮基團(tuán)的直鏈淀粉混合溶于30mL無水二甲基亞砜，室溫條件下通入N2保護(hù)15分鐘，然后加入33.6mg五水硫酸銅和53.2mg抗壞血酸鈉，升溫至50 °C反應(yīng)48小時；反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物用14000截流量透析袋透析48h，冷凍干燥，得到本發(fā)明用于基因和抗腫瘤藥物共傳遞的直鏈淀粉改性物。產(chǎn)率79 %，元素分析結(jié)果顯示樹枝化直鏈淀粉衍生物含N為9.05 %。
[0042]實施例4
[0043]將0.25g 3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸與50mg實施例1所得含疊氮基團(tuán)的直鏈淀粉混合溶于30mL無水二甲基亞砜，室溫條件下通入N2保護(hù)30分鐘，然后加入16.Smg五水硫酸銅和26.6mg抗壞血酸鈉，升溫至40°C反應(yīng)24小時；反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物14000截流量透析袋透析72h，冷凍干燥，得到本發(fā)明用于基因和抗腫瘤藥物共傳遞的直鏈淀粉改性物。產(chǎn)率63%，元素分析結(jié)果顯示樹枝化直鏈淀粉衍生物含N為5.91%。
[0044]實施例5
[0045]將實施例3所得直鏈淀粉改性物(Amy-g-PLLD，3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸接枝率為9.52% )溶解于去離子水中配置成5mg/mL的水溶液3mL，加入15mg的姜黃素，超聲并室溫攪拌24h。將樣品用透析袋透析12h，然后過濾，冷凍干燥，得到包合物。紫外分光法測試姜黃素濃度，計算得到姜黃素負(fù)載率為19.7%。在PBS緩沖液(pH = 7.4)中進(jìn)行體外藥物釋放實驗，得到姜黃素釋放曲線如圖1所示。
[0046]實施例6
[0047]將實施例5所得包合物(Amy-g-PLLD/Curcumin)按照質(zhì)量比10:1與質(zhì)粒DNA (pDNA，含P為9.1 % )混合，室溫條件下靜置30分鐘，使Amy-g-PLLD/Curcumin與pDNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗得到轉(zhuǎn)染率為16.9%，如圖6中的A所示。
[0048]實施例7
[0049]將實施例5所得包合物(Amy-g-PLLD/Curcumin)按照質(zhì)量比20:1與質(zhì)粒DNA (pDNA，含P為9.1 % )混合，室溫條件下靜置30分鐘，使Amy-g-PLLD/Curcumin與pDNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗得到轉(zhuǎn)染率為21.6%，如圖6中的B所示。
[0050]實施例8
[0051 ] 將實施例5所得包合物(Amy-g-PLLD/Curcumin)按照質(zhì)量比30:1與質(zhì)粒DNA (pDNA，含P為9.1 % )混合，室溫條件下靜置30分鐘，使Amy-g-PLLD/Curcumin與pDNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗得到轉(zhuǎn)染率為33.6%，如圖6中的C所示。
[0052]實施例9
[0053]將實施例6、實施例7和實施例8所得復(fù)合物水溶液用于凝膠電泳實驗。設(shè)置空白的pDNA為對照，配置I %的瓊脂糖凝膠，加Glod-view (5 μ L/10mL凝膠)，每個上樣孔加10 μ L混合液，100V電壓電泳lh。結(jié)果如圖2所示。N/P = 20開始，pDNA完全與Amy-g-PLLD/Curcumin形成復(fù)合物，呈中性，pDNA在電泳過程中沒有發(fā)生迀移，而N/P = 10的pDNA沒有完全與Amy-g-PLLD/Curcumin形成復(fù)合物，在電泳的過程中，帶負(fù)電性的游離pDNA向正極迀移而形成熒光條帶。
[0054]實施例10
[0055]將實施例6、實施例7和實施例8所得復(fù)合物水溶液，利用動態(tài)光散射對其平均粒徑進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。在N/P多20時，粒徑變化逐漸穩(wěn)定在170-190nm。
[0056]實施例11
[0057]將實施例6、實施例7和實施例8所得復(fù)合物水溶液，利用zeta電位儀對其表面電性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。隨著N/P值的增加，表面電荷逐漸增大，當(dāng)N/P ^ 20時，表面電位保持在13mV左右。
[0058]實施例12
[0059]分別取10 μ L實施例7和實施例8所得復(fù)合物水溶液，滴在200目表面渡有炭膜的銅網(wǎng)上，濾紙吸干，磷鎢酸溶液染色，濾紙吸干，采用JEM-2010HR型透射電子顯微鏡(Japan)觀察。如圖5所示，復(fù)合物A(N/P = 20)與B(N/P = 30)形成了緊密的球形結(jié)構(gòu)，透射電鏡照片粗略顯示納米粒子直徑在200nm左右。因此，Amy-g-PLLD/Curcumin/pDNA可以在一定條件下形成納米尺寸的顆粒。
[0060]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種用于基因和抗腫瘤藥物共傳遞的直鏈淀粉改性物的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)將干燥直鏈淀粉與1-疊氮-環(huán)氧丙烷混合溶于氫氧化鈉水溶液中，在30?40°C條件下避光攪拌24?36h ;反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物透析，過濾，冷凍干燥得到含疊氮基團(tuán)的直鏈淀粉； (2)將3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸與步驟(I)所得含疊氮基團(tuán)的直鏈淀粉混合溶于無水二甲基亞砜；室溫條件下通入N2保護(hù)15?30分鐘，然后加入五水硫酸銅和抗壞血酸鈉，升溫至40?50°C反應(yīng)24?48小時；反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物透析，冷凍干燥，得到用于基因和抗腫瘤藥物共傳遞的直鏈淀粉改性物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(I)所述干燥直鏈淀粉是將直鏈淀粉置于真空干燥箱中，在50?80°C條件下干燥12?48小時得到；所述1-疊氮-環(huán)氧丙胺和直鏈淀粉中糖環(huán)的摩爾比為1:(1?2);所述氫氧化鈉水溶液的濃度為每100毫升水中加入0.4?0.8克氫氧化鈉計；所述氫氧化鈉水溶液的使用量以每100毫升氫氧化鈉水溶液溶解0.5?I克干燥直鏈淀粉；所述透析條件為14000截流量透析袋透析48?72小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)所述3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸是按專利號為ZL201210005079.8的中國發(fā)明專利中所述的方法制備得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)所述含疊氮基團(tuán)的直鏈淀粉中的糖環(huán)、3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸、五水硫酸銅、抗壞血酸鈉的摩爾比為1:(8?10):(I?1.2): (2?2.5);所述無水二甲基亞砜的制備方法按照以下操作步驟:將氫化鈣加入到二甲基亞砜中攪拌6?24小時，減壓蒸餾，得到無水二甲基亞砜，所述氫化鈣的加入量以每500毫升二甲基亞砜中加入I?2克計；所述無水二甲基亞砜的使用量以平均每0.5?I克含疊氮基團(tuán)的直鏈淀粉使用100毫升無水二甲基亞砜計；所述透析條件為14000截流量透析袋透析48?72小時；所述室溫為5?35°C。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1?4任一項所述制備方法得到的用于基因和抗腫瘤藥物共傳遞的直鏈淀粉改性物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于基因和抗腫瘤藥物共傳遞的直鏈淀粉改性物在制備基因和抗腫瘤藥物共傳遞物質(zhì)中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于按照以下操作步驟: (1)將用于基因和抗腫瘤藥物共傳遞的直鏈淀粉改性物溶解于去離子水中配置成5?.10毫克/毫升的水溶液，加入姜黃素，超聲30?60分鐘并在室溫下攪拌12?24小時；將樣品用透析袋透析，然后過濾，冷凍干燥得到包合物； (2)將包合物溶解于PBS緩沖液中，加入質(zhì)粒DNA，混合均勻后于37?40°C條件下靜置.15?30分鐘，使包合物與pDNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:步驟(I)所述室溫為5?35°C;所述用于基因和抗腫瘤藥物共傳遞的直鏈淀粉改性物與姜黃素的質(zhì)量比為1: (I?1.5);所述透析條件為14000截流量透析袋透析6?12小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:步驟⑵所述PBS緩沖液pH值為7.2?.7.4 ;所述PBS緩沖液的使用量以每10毫升PBS緩沖液加入5?10克包合物計；所述質(zhì)粒 DNA在復(fù)合物中的濃度為0.2?0.8微克/微升。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程材料領(lǐng)域，公開了一種用于基因和抗腫瘤藥物共傳遞的直鏈淀粉改性物及制備方法和在制備基因和抗腫瘤藥物共傳遞物質(zhì)中的應(yīng)用。該方法操作步驟為：將直鏈淀粉疊氮化，與含炔基的樹狀聚賴氨酸進(jìn)行點擊反應(yīng)，合成直鏈淀粉改性物，利用磁力攪拌、超聲使直鏈淀粉改性物包合疏水性抗腫瘤藥物，同時利用其樹狀聚賴氨酸側(cè)鏈上的大量氨基基團(tuán)與質(zhì)粒DNA發(fā)生靜電復(fù)合。本發(fā)明具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)高效且易于操作等優(yōu)點，有望在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮其潛在的應(yīng)用價值。
【IPC分類】A61K47-36, A61K48-00, C12N15-87, C08G81-00, C12N15-85
【公開號】CN104530441
【申請?zhí)枴緾N201510026436
【發(fā)明人】張黎明, 龐家棟, 莊寶雄, 王捷
【申請人】中山大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月19日