反硝化無色桿菌zjut1104及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株反硝化無色桿菌zjutll04(Achromobacter denitrificans Zjutll04)及在生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用，該菌株具有很好的手性選擇性拆分農(nóng)藥中間體的作 用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] N取代苯基a氨基丙酸是一類重要的手性合成中間體，特別是在農(nóng)藥領(lǐng)域，是 很多手性農(nóng)藥的關(guān)鍵中間體，由該類中間體合成的農(nóng)藥已經(jīng)形成了一類重要的農(nóng)藥體 系一酰胺類農(nóng)藥，其中甲霜靈、氯霜靈、呋霜靈、異霜靈和苯霜靈為殺菌劑，異丙甲草胺、新 燕靈和麥草伏為除草劑。這些農(nóng)藥不同光學(xué)異構(gòu)體的生物活性是不同的，是典型的旋光活 性農(nóng)藥。
[0003] 甲霜靈是酰胺類殺菌劑中最為普遍的成員，在世界防治卵菌亞綱病害（霜霉病和 晚疫?。┦袌錾霞姿`產(chǎn)品占15%。甲霜靈同RNA聚合-I模板復(fù)雜作用，抑制核糖核苷 酸三磷酸酯結(jié)合為核蛋白體RNA。甲霜靈因其烷基部分有一個(gè)不對稱碳且無限制構(gòu)形異構(gòu) 物（atropoisomer)不對稱苯環(huán)取代基而具有手性。因此，甲霜靈由一對具有R和S構(gòu)型的 對映異構(gòu)體組織。外對phyflaophtorainfextants和Pythiumultimmn生活活性測試表 明R異構(gòu)體大約比S異構(gòu)體高1000倍。體內(nèi)測試顯示活性具有較小差異，R體比S體高3 倍。因此，甲霜靈立體異構(gòu)體具有相同的作用模式，但到達(dá)或者與受體結(jié)合的有效性方面具 有顯著的差異。R體相對于其對映體具有更高的生物活性，因此甲霜靈的殺菌活性主要來源 于R體。外消旋甲霜靈目前在一些國家正在被主要由具有較高生物活性的R體組成的精甲 霜靈所代替，典型的精甲霜靈產(chǎn)品由97. 5%的R體以及2. 5%的s體構(gòu)成。光學(xué)純或異構(gòu) 體產(chǎn)品替代外消旋（或異構(gòu)體混合物）產(chǎn)品不僅提高了使用藥效而且還能減少釋放到環(huán) 境中的農(nóng)藥總量，減少非活性異構(gòu)體在生物圈內(nèi)的擴(kuò)展，從而減小對非靶標(biāo)生物的潛在副 作用。而且，光學(xué)純產(chǎn)品的使用還有利于產(chǎn)品的生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存。
[0004] 目前，大量的手性化合物的制備是通過化學(xué)拆分法完成的。利用生物催化拆分 手性化合物比化學(xué)拆分法具有明顯的優(yōu)越性：（1)酶催化的反應(yīng)通常具有高度的立體專一 性。因此得到的產(chǎn)物旋光純度很高，適于作各種生物活性和藥理試驗(yàn)。（2)副反應(yīng)少，產(chǎn) 率高，產(chǎn)品分離提純簡單。（3)酶催化的反應(yīng)大多在很溫和的條件下進(jìn)行，溫度區(qū)間0? 500°C，pH值接近中性。因此沒有設(shè)備腐蝕問題，生產(chǎn)安全性也高。（4)酶無毒，易降解，不 會(huì)造成環(huán)境污染，適于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0005] 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，南極假絲酵母脂肪酶和假單胞菌脂肪酶對該農(nóng)藥中間體實(shí)現(xiàn)了手 性拆分，主要產(chǎn)物構(gòu)型均為R型。南極假絲酵母脂肪酶催化速率比較高，立體選擇性低，eep 達(dá)到了 69. 4%，假單胞菌脂肪酶的手性選擇性相當(dāng)好，eep達(dá)到了 99%，而催化速率比較慢。 本發(fā)明菌株對該農(nóng)藥中間體，既具有很好的立體選擇性，又有很高的催化速率。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種具有較好立體選擇性的菌株--反硝化無色桿菌 zjutll04(Achromobacterdenitrificans)及其在拆分農(nóng)藥中間體一2, 6-二甲基苯基氨 基丙酸甲酯中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明提供一株新菌株一反硝化無色桿菌（Achromobacterdenitrificans) Zjutll04,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014年10月19日，保藏編號 CCTCCNO:M2014495,保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，郵編430072。
[0009] 本發(fā)明還提供一種所述反硝化無色桿菌zjutll04在拆分2, 6-二甲基苯基氨 基丙酸甲酯中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用以反硝化無色桿菌zjutll04經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕 菌體或濕菌體經(jīng)超聲破碎后的破碎混合液為催化劑，以2, 6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯為 底物，以吐溫80為助溶劑，以pH= 8. 0的磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在37°C、 180rpm條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)完全后，獲得含（S) -2, 6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯和 (R)-2, 6-二甲基苯基氨基丙酸的混合液，將混合液分離純化，獲得（R)-2, 6-二甲基苯基氨 基丙酸。
[0010] 進(jìn)一步，所述催化劑用量以濕菌體重量計(jì)，所述濕菌體用量為10-80g/L反應(yīng)體 系，所述底物終濃度為48mmol/L反應(yīng)體系，所述輔助底物的終濃度為20ml/L反應(yīng)體系。
[0011] 進(jìn)一步，所述濕菌體超聲破碎的條件為：將濕菌體與磷酸鹽緩沖液混合，在冰浴、 500w條件下超聲破碎lOmin，獲得超聲破碎混合液；所述磷酸鹽緩沖液的體積用量以濕菌 體重量計(jì)為25ml/g。
[0012] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述濕菌體的制備方法為：
[0013] (1)將反硝化無色桿菌zjutl 104接種至斜面培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)1?2天，獲得斜 面菌體；所述每升斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：蛋白胨l〇g，酵母粉5g，NaCl 10g，瓊脂15? 2〇g，自來水l〇〇〇mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7. 0,121°C滅菌20min ;
[0014] (2)將斜面菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)12h，獲得種子液；所述每升種 子培養(yǎng)基終濃度組成為：蛋白胨l〇g，酵母粉5g，葡萄糖10g，K2HP042g，MgS040. 2g，自來水 1000mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0，115°C滅菌20min ;
[0015] (3)將種子液以體積濃度1 %?10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在30°C、180r/ min、體積裝液量5%的條件下培養(yǎng)24h，將發(fā)酵液離心，棄上清液，獲得濕菌體；
[0016] 每升發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成：蛋白陳5g，酵母粉2. 5g，葡萄糖lg，橄欖油10g， K2HP04lg，MgS040. 2g，自來水 1000mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為 7. 0,115。。滅菌 20min〇
[0017] 進(jìn)一步，所述混合液分離純化的方法為：反應(yīng)結(jié)束后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)混合液的 pH值至8-11，加入等體積的乙醚萃?。▋?yōu)選萃取1-3次，每次萃取時(shí)間10min以上），分層 (優(yōu)選用分液漏斗進(jìn)行兩相分離），得到水相a和有機(jī)相a;用鹽酸調(diào)節(jié)水相a的pH值為 2-5,加入等體積的乙酸乙酯萃?。▋?yōu)選萃取時(shí)間10min以上），分層（優(yōu)選用分液漏斗進(jìn)行 兩相分離），得到水相b和有機(jī)相b;將有機(jī)相b在35°C-60°C，轉(zhuǎn)速為50rpm-150rpm條件 下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，取濃縮物，即獲得（R)-2, 6-二甲基苯基氨基丙酸。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：
[0019] 本發(fā)明提供一株新菌株一反硝化無色桿菌zjutl104,該菌株對農(nóng)藥