一種vbnc聯(lián)苯降解菌的分離篩選方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于污染物微生物降解領(lǐng)域，尤其涉及一種VBNC聯(lián)苯降解菌的分離篩選方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]自然環(huán)境中存在大量的微生物，利用純培養(yǎng)技術(shù)僅能對自然界中0.01%-10%的微生物進(jìn)行分離鑒定，尚有90%以上的微生物因處于活的但非可培養(yǎng)(“viable butnon-culturable”，簡稱VBNC)狀態(tài)而未被認(rèn)知。VBNC狀態(tài)菌作為自然界中未能開發(fā)利用的絕大部分微生物資源，雖然基于非培養(yǎng)手段可以獲取其多樣性及菌群結(jié)構(gòu)信息，但對于菌株相關(guān)生態(tài)功能及基因型的闡述，分離純培養(yǎng)是不可或缺的。對VBNC狀態(tài)菌可培養(yǎng)化的研宄，將為重新認(rèn)識和評價(jià)微生物在食品發(fā)酵、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域的作用提供新的科學(xué)依據(jù)。
[0003]藤黃球菌(MicrococcusIuteus)復(fù)蘇促進(jìn)因子(resuscitat1n-promotingfactor,簡稱Rpf)的發(fā)現(xiàn)是VBNC狀態(tài)菌復(fù)蘇的主要突破。藤黃球菌Rpf具有胞壁溶解酶活性，其活性中心非常保守，預(yù)測該位點(diǎn)在細(xì)胞壁溶解過程中起到重要作用。另外，由藤黃球菌分泌的Rpf蛋白的活性要高于合成的Rpf蛋白，且純Rpf蛋白易失活。同時(shí)，在藤黃球菌上清液中分離出至少具有兩種Rpf功能(溶解酶活性)的蛋白，其分子量大于Rpf蛋白。因此，藤黃球菌胞外分泌物(“Extracellular organic matter”，簡稱EOM或促進(jìn)劑SRpf)中含有至少3種具有溶解酶活性的蛋白，除此之外，促進(jìn)劑SRpf中還含有多糖、脂類和多肽等多種大分子物質(zhì)，可為微生物的生長提供碳源及氮源。由此可知，基于環(huán)境功能與微生物資源角度，利用促進(jìn)劑SRpf探索環(huán)境中的VBNC狀態(tài)菌群，更為經(jīng)濟(jì)方便。
[0004]聯(lián)苯(Biphenyl)是一種有兩個(gè)苯環(huán)組成的芳香族化合物，天然存在于煤焦油、原油、天然氣中，通過化石燃料的燃燒進(jìn)入環(huán)境中。在工業(yè)生產(chǎn)中，聯(lián)苯中的氫原子被氯原子不同程度取代所形成209種同系物，這一類化合物稱為多氯聯(lián)苯(Polychlorinatedbiphenyls,簡稱PCBs)。PCBs因具有較好的阻燃性、高絕緣性及熱穩(wěn)定性，曾被廣泛應(yīng)用于變壓器、電容器絕緣油、燃料分散劑、潤滑劑、增塑劑和涂料等。PCBs屬于難降解有機(jī)污染物，由于環(huán)境持久性及“三致”效應(yīng)而成為目前廣泛關(guān)注的典型有機(jī)污染物，雖然PCBs已禁用多年，但它所造成的環(huán)境污染問題隨著研宄的深入而日益突出。傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法因存在低效、二次污染等問題而成為應(yīng)用瓶頸，微生物作為大量存在的自然資源，且微生物降解治理技術(shù)具有安全、高效、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，因此，篩選和構(gòu)建高效PCBs降解菌成為修復(fù)PCBs污染環(huán)境的研宄熱點(diǎn)。
[0005]自1973年Ahmed首次證明聯(lián)苯降解微生物具有降解PCBs同系物的功能。從此，更多的研宄工作開始關(guān)注聯(lián)苯降解菌對PCBs同系物轉(zhuǎn)化能力這一方面。PCBs好氧降解菌株研宄主要是以聯(lián)苯作為生長底物進(jìn)行馴化篩選，再測試其降解PCBs的能力。另外，在好氧條件下，某些聯(lián)苯降解菌通過bph途徑共代謝PCB同系物?，F(xiàn)今已有較多PCBs降解菌的報(bào)道，包括革蘭氏陰性菌:Alcaligenes、Janibacter> Acinetobacter> Acidovorax、Cupriavidus、Comamonas、Enterobacter、Sphingomonas、Ralstonia、Burkholderia、Paenibacillus、Pseudomonas> Achromobacter 和革蘭氏陽性菌:Rhodococcus、Arthrobacter、Nocardia、Bacillus、Micrococcus、Corynebacterium 等。雖然關(guān)于 PCBs 的微生物降解已投入大量的研宄工作，但大多仍限于實(shí)驗(yàn)室研宄階段，PCBs高效降解功能菌種資源匱乏成為其推廣應(yīng)用的最大瓶頸。因此，如何從作為自然環(huán)境中絕大部分微生物資源的VBNC菌群中，尋找潛在聯(lián)苯和PCBs降解菌群，提高菌株的降解效能成為打破微生物修復(fù)技術(shù)在PCBs污染環(huán)境中應(yīng)用瓶頸的關(guān)鍵所在。
[0006]綜上所述，利用促進(jìn)劑SRpf分離篩選PCBs污染環(huán)境中的非可培養(yǎng)狀態(tài)菌群，可為尋找高效PCBs降解菌及新的菌種資源提供新的途徑。另外，該VBNC狀態(tài)菌的篩選方法亦可用于篩選其它有機(jī)污染物降解菌群，為探索新的菌種資源及環(huán)境功能菌，提供一種安全、廉價(jià)、高效的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有PCBs污染環(huán)境的微生物修復(fù)技術(shù)中存在的菌種分離難、降解效能低、高效降解菌匱乏的不足，提供一種VBNC聯(lián)苯降解菌的篩選方法及其應(yīng)用。菌株TG9是依據(jù)本發(fā)明所述篩選方法獲得的多氯聯(lián)苯降解菌之一，該菌能降解高濃度的聯(lián)苯，亦可降解低氯代多氯聯(lián)苯及低氯代苯甲酸。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種VBNC聯(lián)苯降解菌的分離篩選方法，包括以下步驟:
[0009](I)將藤黃球菌接種于LMM液體培養(yǎng)基，使其培養(yǎng)液OD6tltolS 0.05-0.2 ；LMM液體培養(yǎng)基組成是:2.5-4.5g/L 的 NH4Cl, 1.0-2.0g/L 的 KH2PO4,0.005g/L 的生物素，0.02g/L的 L-蛋氨酸，0.04g/L 的維生素 BI，0.5-1.5g/L 的肌苷，0.03g/L 的 MgSO4,8.0-10.0g/L 的L-乳酸鋰鹽，1.5-3.0ml/L的礦質(zhì)鹽溶液，pH為6.5-8.0 ;培養(yǎng)24_36h，獲得種子培養(yǎng)液；
[0010](2)將步驟⑴獲得的種子培養(yǎng)液按3-5% (v/v)的接種量接種至LMM液體培養(yǎng)基中，160r/min，培養(yǎng)48_60h，將發(fā)酵液離心(8000-10000r/min) 10-15min去除菌體，經(jīng)0.22 μπι過濾膜進(jìn)行無菌過濾，所獲得的上清液即為促進(jìn)劑SRpf，其蛋白含量為23.96-25.34mg/L，保存于-20°C條件下備用；
[0011](3)制備處理組和對照組的篩選培養(yǎng)基；將步驟(2)得到的促進(jìn)劑SRpf按體積分?jǐn)?shù)為5-10%添加至無機(jī)鹽培養(yǎng)基中獲得處理組培養(yǎng)基；對照組培養(yǎng)基為不添加促進(jìn)劑SRpf的無機(jī)鹽培養(yǎng)基；其中無機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成是:l_2g/L的KH2PO4, 2.5-3.5g/L的K2HPO4.3Η20，0.2g/L 的 MgSO4,0.02g/L 的 FeSO4.7H20，lg/L 的 NaCl，2_4g/L 的(NH4)2SO4,0.0 lg/L的CaCl2，2mL/L的微量鹽溶液，無機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH為7.3-7.5 ;所述微量鹽溶液的組成為:4mg/L 的 MoO3, 28mg/L 的 ZnSO4.5Η20，0.02mg/L 的 CuSO4.5Η20，4mg/L 的 H3BO3,4mg/L 的 MnSO4.5H20，4mg/L 的 CoCl2.6H20，溶劑為水；
[0012](4)從受PCBs長期污染的區(qū)域采集污染底泥樣，取底泥樣分別接種至步驟(3)中配制的兩種刷選培養(yǎng)基中，得到兩個(gè)培養(yǎng)體系；其中，PCBs污染底泥與篩選培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比為46-72g/L ；
[0013](5)將聯(lián)苯分別加入步驟(4)中所述的培養(yǎng)體系中進(jìn)行連續(xù)傳代富集馴化，聯(lián)苯在培養(yǎng)體系中的溶度為500-2000mg/L ； 180-200r/min搖床培養(yǎng)，每代培養(yǎng)時(shí)間為3_5d，傳代培養(yǎng)3-4次，得到兩組富集培養(yǎng)液；
[0014](6)將步驟(5)中所得的兩組富集培養(yǎng)液分別稀釋，涂布于瓊脂平板，并噴灑聯(lián)苯，挑取能使瓊脂平板上出現(xiàn)透明圈的菌落劃線純化，得到純菌株，經(jīng)形態(tài)特征及16S rRNA基因序列比對分析，獲得處理組特有的菌株，即為處于VBNC狀態(tài)的聯(lián)苯降解菌；
[0015](7)將步驟(6)獲得的處理組特有的菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列及表型、化學(xué)特征比對分析，獲得新種菌株TG9 ;所述菌株TG9保存在中國專利局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為:CGMCC 1.12975，分類命名為:紅球菌(Rhodococcus sp.);菌株 TG9 的 16S rRNA 是 SEQ ID N0.1 所不的基因序列。
[0016]進(jìn)一步地，所述步驟⑵得到的促進(jìn)