一種歐洲鰻鱺肝臟細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種歐洲鰻鱺Anguilla)肝臟細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于海水魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代，自Wolf等1962年建立第一個(gè)真骨魚(yú)類(lèi)永久性細(xì)胞系——虹鱒生殖腺細(xì)胞系RTG-2以來(lái)，國(guó)內(nèi)外已建立了 250余株魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系，有40余種病毒采用細(xì)胞培養(yǎng)分離成功，魚(yú)類(lèi)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的成功更是有力地促進(jìn)了基因工程的發(fā)展。魚(yú)類(lèi)研究實(shí)驗(yàn)對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)所、設(shè)備和水體環(huán)境的維持有較高的要求，以魚(yú)類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，有著活體魚(yú)無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn):(I)成本低，細(xì)胞系的維護(hù)不需要大型的養(yǎng)殖設(shè)備和大量的換水與充氣；(2)重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)條件可以精確控制；(3)取樣、觀測(cè)簡(jiǎn)便易行，利于進(jìn)行大量樣本的分析。魚(yú)類(lèi)體細(xì)胞系模型研究幾十年來(lái)發(fā)展迅速，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原學(xué)、藥理學(xué)、生理學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)以及資源保護(hù)等各方面，在病毒學(xué)研究中尤其具有重要的地位，被視為病毒性病原分離、鑒定和特性研究的基礎(chǔ)。
[0003]鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)水產(chǎn)業(yè)重要的支柱行業(yè)，其年產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的2/3，單項(xiàng)產(chǎn)品出口值在水產(chǎn)品中位居榜首。歐洲鰻鱺(AnguiIla AnguiIla)屬鰻鱺目
鰻鱺科鰻鱺屬{Anguilla)，原產(chǎn)于大西洋，于 1993 年首次引入我國(guó)，并于同年實(shí)現(xiàn)配套飼料國(guó)產(chǎn)化；自引養(yǎng)成功以來(lái)，歐鰻養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，90年代末歐洲鰻鱺年產(chǎn)量超過(guò)日本鰻鱺，成為我國(guó)最重要的養(yǎng)殖鰻鱺品種，其肉質(zhì)細(xì)嫩，味美，富含蛋白質(zhì)、多種維生素及不飽和脂肪酸，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，有“軟黃金”之稱(chēng)。由于養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖布局不合理、密度過(guò)大、水流不暢等問(wèn)題普遍發(fā)生，加之時(shí)有投喂變質(zhì)餌料和濫用藥物的狀況，導(dǎo)致魚(yú)體免疫力下降和水體污染，各類(lèi)病害頻繁爆發(fā)，其中不乏病毒性病例，而當(dāng)前已有的歐洲鰻鱺細(xì)胞系模型極少，遠(yuǎn)不能滿足研究需要。
[0004]由于歐洲鰻鱺降河洄游的繁殖習(xí)性和復(fù)雜多變的生活史，其人工繁殖至今仍是未解的世界級(jí)技術(shù)難題；而歐鰻胚胎和低齡幼體的難以獲取，和被列為瀕危物種后對(duì)玻璃鰻進(jìn)出口的限制，客觀上增大了歐洲鰻鱺體細(xì)胞系建立的難度，更加突顯出這一亟需填補(bǔ)的技術(shù)空白的重要性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種歐洲鰻鱺肝臟細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)和細(xì)胞模型庫(kù)的不足，并滿足對(duì)歐洲鰻鱺進(jìn)行病原學(xué)分析和生理特性、功能基因組等研究的應(yīng)用需要。
[0006]本發(fā)明所涉及的歐洲鰻鱺肝臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其步驟如下:
1)歐洲鰻鱺的試前準(zhǔn)備:健康歐洲鰻鱺幼體黑仔鰻在潔凈海水中于室內(nèi)暫養(yǎng)I?2周，期間不喂食餌料；
2)歐洲鰻鱺肝臟組織的獲取:將步驟I)準(zhǔn)備好的仔鰻置于碎冰中行冰凍麻醉，至魚(yú)體對(duì)物理刺激應(yīng)激行為消失為止；以2%碘酊棉球充分擦拭魚(yú)體表面去除黏液后，再以75%酒精棉球擦拭魚(yú)體表面2?3次，由側(cè)面剪開(kāi)體壁，取出肝臟組織，置于(TC預(yù)冷并含青霉素及鏈霉素雙抗的滅菌無(wú)鈣鎂D-Hanks平衡鹽溶液中，清洗5?6次；
3)原代培養(yǎng):將步驟2)得到的歐洲鰻鱺肝臟組織剪碎成0.5mm3?Imm3大小的組織塊，以步驟2)所述滅菌無(wú)鈣鎂D-Hanks平衡鹽溶液漂洗；用不含血清的L-15培養(yǎng)基潤(rùn)濕培養(yǎng)瓶底面，將漂洗后的組織塊移入25mL培養(yǎng)瓶中，以0.3cm?0.5cm的間距均勻排列；倒置瓶身于20°C密閉培養(yǎng)6?8小時(shí)使組織塊貼壁后，在培養(yǎng)瓶中加入原代及早期傳代培養(yǎng)用完全培養(yǎng)液，緩慢翻正瓶身，使培養(yǎng)液浸潤(rùn)組織塊，于20°C恒溫下啟動(dòng)原代培養(yǎng)；
4)早期傳代培養(yǎng):收集生長(zhǎng)良好的原代培養(yǎng)物進(jìn)行早期傳代培養(yǎng)，傳代前棄去培養(yǎng)液和脫落的組織塊，用0.25%胰酶潤(rùn)洗細(xì)胞層，棄去，再加入0.25%胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞呈收縮分離態(tài)勢(shì)時(shí)棄去胰酶，加原代及早期傳代培養(yǎng)用完全培養(yǎng)液中止消化，以彎頭滴管吹打培養(yǎng)物至細(xì)胞和組織塊大部分分散脫落，收集細(xì)胞和組織懸浮液，100rpm離心3分鐘，去除上清后用完全培養(yǎng)液重懸沉淀，依照細(xì)胞和組織塊數(shù)量以1:1?2:1的比例在27°C下進(jìn)行富集化培養(yǎng)，重復(fù)以上步驟直至確認(rèn)培養(yǎng)物連續(xù)數(shù)代無(wú)污染跡象，傳代后細(xì)胞能順利形成鋪滿瓶底的單層；
5)常規(guī)傳代培養(yǎng):細(xì)胞能穩(wěn)定形成單層后對(duì)其進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)，以顯微鏡法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)觀察，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)均勻的輕微堆疊現(xiàn)象時(shí)即行傳代，用0.25%胰酶潤(rùn)洗細(xì)胞層，棄去，再加入0.25%胰酶消化細(xì)胞30秒至I分鐘，待上層細(xì)胞收縮變圓時(shí)棄去胰酶，力口入常規(guī)傳代培養(yǎng)用完全培養(yǎng)液，用彎頭滴管輕柔吹打至上層細(xì)胞脫落制成細(xì)胞懸液，將全部細(xì)胞懸液移入新瓶，于27°C恒溫下進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)；
6)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇:當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入常規(guī)傳代培養(yǎng)階段后，對(duì)其分批進(jìn)行液氮冷凍保存，凍存液組成為70%L-15、20%胎牛血清以及10%DMS0 ;復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，以37°C水浴迅速解凍樣品，吸出細(xì)胞懸液后與常規(guī)傳代培養(yǎng)用完全培養(yǎng)液混勻接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，12小時(shí)后更換培液，去除未成活細(xì)胞和DMSO成分后繼續(xù)培養(yǎng)。
[0007]步驟3)和4)所述原代及早期傳代用完全培養(yǎng)液是以L-15培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，含終濃度為15%的胎牛血清，終濃度為200U/mL的青霉素，以及終濃度為200 μ g/mL的鏈霉素的完全培養(yǎng)液。
[0008]步驟5)所述常規(guī)傳代培養(yǎng)用完全培養(yǎng)液是以L-15培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，含終濃度為10%的胎牛血清，不含抗生素及其他營(yíng)養(yǎng)添加物的完全培養(yǎng)液。
[0009]本發(fā)明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。
[0010]根據(jù)上述細(xì)胞系構(gòu)建方法，建立了一株歐洲鰻鱺肝臟細(xì)胞系EL，該細(xì)胞系于2014年12月16日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記入冊(cè)編號(hào)為CCTCC N0:C2014239o
[0011]所述歐洲鰻鱺肝臟細(xì)胞系EL，該細(xì)胞系具有以下生物學(xué)特性:
O該細(xì)胞系為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，在體外連續(xù)傳代60代仍可保持該形態(tài)特征。
[0012]2)該細(xì)胞系增殖能力強(qiáng)，存活時(shí)間長(zhǎng)，在每周更換培養(yǎng)基一次的條件下體外生存期限可穩(wěn)定達(dá)到70?90天，最長(zhǎng)可超過(guò)150天，在體外連續(xù)傳代60代仍然保持該生理特征。
[0013]本發(fā)明還保護(hù)了所述的歐洲鰻鱺肝臟細(xì)胞系EL作為水產(chǎn)動(dòng)物病毒宿主細(xì)胞的應(yīng)用，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EL細(xì)胞，在維持性培養(yǎng)基環(huán)境下接種鰻鱺皰疹病毒HVA-1I，可產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變(cytopathic effect , CPE)現(xiàn)象。
[0014]所述維持性培養(yǎng)基以L-15培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，包含終濃度為2%的胎牛血清。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:
1)本發(fā)明的技術(shù)方案簡(jiǎn)便易行，篩選條件簡(jiǎn)單明晰，所用試劑均為魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的常規(guī)用品，無(wú)須添加任何特殊營(yíng)養(yǎng)成分，從而保證了所構(gòu)建的歐洲鰻鱺肝臟細(xì)胞系有廣闊的應(yīng)用空間，有效填補(bǔ)了歐洲鰻鱺體細(xì)胞系模型建立的技術(shù)空白；
2)所構(gòu)建的歐洲鰻鱺肝臟細(xì)胞系(EL)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)均一，為成纖維樣細(xì)胞，能連續(xù)傳代60代以上，且凍存復(fù)蘇后貼壁良好，生長(zhǎng)穩(wěn)定，能直接用于水產(chǎn)病毒學(xué)、歐洲鰻鱺細(xì)胞生物學(xué)特性及免疫抗病基因功能的研究，并已被證實(shí)對(duì)鰻鱺皰疹病毒敏感；
3)該構(gòu)建方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性強(qiáng)，成本適中，也適用于其他歐洲鰻鱺體細(xì)胞系。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1:歐洲鰻鱺肝臟細(xì)胞原代培養(yǎng)光鏡照片:a&b、不同類(lèi)型細(xì)胞從組織塊中遷出；c&d、細(xì)胞圍繞組織塊形成不同形態(tài)的生長(zhǎng)暈。
[0017]圖2:歐洲鰻鱺肝臟細(xì)胞傳代培養(yǎng)光鏡照片:a、第2代EL細(xì)胞；b、第5代EL細(xì)胞；C、第11代EL細(xì)胞；d、第21代EL細(xì)胞；e、第41代EL細(xì)胞；f、第70代EL細(xì)胞。
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