一種通過(guò)大鼠應(yīng)力骨折模型募集間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種募集間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，具體涉及一種通過(guò)建立大鼠應(yīng)力骨折 模型募集間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在組織器官損傷修復(fù)、組織工程和疾病治療領(lǐng)域，盡管胚胎干細(xì)胞等呼聲很熱，但 是最理想的細(xì)胞依然是自體組織細(xì)胞。因此如何獲得和利用自體組織、自體干細(xì)胞一直是 研究人員關(guān)注的問(wèn)題。
[0003] 現(xiàn)在，干細(xì)胞的來(lái)源和應(yīng)用理論大體分為3個(gè)重要方向，第一，胚胎干細(xì)胞 (embryonic stem cell, ES);第二，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSC);第三，利 用基因重編程（reprogramming)改造體細(xì)胞培育誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stemcell，iPS)。目前ES的研究由于受倫理學(xué)爭(zhēng)議、免疫排斥、實(shí)驗(yàn)技術(shù)限制等影響，阻礙 了其研究和在臨床治療中的應(yīng)用。間充質(zhì)干細(xì)胞因可以實(shí)現(xiàn)自體干細(xì)胞移植，而且具有體 內(nèi)遷移與增殖分化并參與修復(fù)過(guò)程的特性，而在近年成為研究熱點(diǎn)。目前，多采用消化法分 離骨折斷端組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞，這種方法需要多種酶的參與，操作時(shí)間長(zhǎng)，而且酶的使 用會(huì)降低細(xì)胞的活力、減少細(xì)胞數(shù)目。
[0004] 在骨科臨床中，應(yīng)用自體間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)移植治療股骨頭壞死和骨不連等疾 病取得了一定的療效。在骨折治療中，隨著生物學(xué)內(nèi)固定理念的創(chuàng)新和新技術(shù)的應(yīng)用，認(rèn) 識(shí)到了保護(hù)血運(yùn)、建立穩(wěn)定性和骨折對(duì)位三者平衡對(duì)建立骨折愈合優(yōu)良生物力學(xué)與生物學(xué) 環(huán)境的重要性。骨折愈合需適當(dāng)?shù)纳锪W(xué)環(huán)境和最佳應(yīng)力水平，大量研究表明，在骨折 愈合早期，微動(dòng)能夠促進(jìn)骨折愈合：①適當(dāng)?shù)奈?dòng)可促進(jìn)骨折區(qū)毛細(xì)血管形成和PGE2的釋 放，PGE2具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨作用，可加速未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞在有氧條件下不斷分化 為成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)骨折愈合；②骨細(xì)胞可以感受機(jī)械應(yīng)力的刺激，骨細(xì) 胞、成骨細(xì)胞等代謝活性增加；③前列腺素合成增加，促進(jìn)骨細(xì)胞增殖；④延長(zhǎng)骨折修復(fù)的 炎癥期，炎癥期細(xì)胞及毛細(xì)血管均較旺盛，釋放許多生化介質(zhì)、骨生成因子等，使局部組織 細(xì)胞釋放成骨活性物質(zhì)的能力恢復(fù)，從而誘導(dǎo)局部間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，分化為成骨細(xì)胞或 成軟骨細(xì)胞；⑤微動(dòng)引起的生物反應(yīng)參與了啟動(dòng)新骨形成的細(xì)胞募集和分化，所以骨折愈 合早期為力學(xué)因素促進(jìn)骨折愈合的最有效時(shí)期。但是關(guān)于微動(dòng)促進(jìn)骨折愈合的細(xì)胞學(xué)機(jī)制 仍不十分清楚，如果闡明了微動(dòng)與細(xì)胞分子活動(dòng)之間的關(guān)系，將有可能通過(guò)控制力學(xué)環(huán)境 來(lái)促進(jìn)骨折愈合，對(duì)其深入研究，最終實(shí)現(xiàn)骨折病人量化控制康復(fù)過(guò)程，使康復(fù)過(guò)程引起的 微動(dòng)始終處于有利骨折愈合的安全范圍，才能有效避免盲目康復(fù)引起的各種骨折并發(fā)癥， 實(shí)現(xiàn)骨折治療目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種符合臨床特點(diǎn)的，操作簡(jiǎn)單、 科學(xué)合理的通過(guò)大鼠應(yīng)力骨折模型募集間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，通過(guò)控制固定骨折處的力學(xué) 環(huán)境，可以募集較多數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞參與骨折愈合的過(guò)程。有研究表明，在骨折初期， 骨折局部只有少量的成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞，如果僅依靠此時(shí)成骨細(xì)胞的數(shù)量，換算股骨 干骨折愈合時(shí)間需要200-1000年。實(shí)際上，被骨折創(chuàng)傷激活的各種細(xì)胞在骨折愈合不同階 段會(huì)產(chǎn)生各種相應(yīng)的生物活性物質(zhì)，極大地加速了骨折愈合過(guò)程。首先是間充質(zhì)干細(xì)胞的 增殖和分化，這是骨折愈合的前提和關(guān)鍵。因此增加骨折局部間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量成為促 進(jìn)骨折愈合的重要基礎(chǔ)。本發(fā)明方法通過(guò)控制力學(xué)環(huán)境募集更多的間充質(zhì)干細(xì)胞，間充質(zhì) 干細(xì)胞增殖和分化，使成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞數(shù)量劇增，有效促進(jìn)骨折愈合。本發(fā)明對(duì)指導(dǎo) 骨折治療和量化控制骨折康復(fù)過(guò)程有重要的臨床意義。首先明確了骨折愈合早期是募集間 充質(zhì)干細(xì)胞的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)也是預(yù)防關(guān)節(jié)粘連的關(guān)鍵時(shí)期，因此，肢體康復(fù)宜早期進(jìn)行而 且需要有限量的康復(fù)。肢體康復(fù)活動(dòng)的應(yīng)力既能使骨折斷端募集間充質(zhì)干細(xì)胞，又能防止 肢體肌肉萎縮和關(guān)節(jié)粘連。肢體康復(fù)活動(dòng)是治療骨折的重要措施，決定骨折治療的最終效 果。但功能康復(fù)引起的微動(dòng)必須始終處于有利骨折愈合的安全范圍，本發(fā)明方法能夠幫助 確定肢體康復(fù)的安全范圍，從而實(shí)現(xiàn)骨折病人量化控制康復(fù)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)骨折治療目標(biāo)。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)方案理論依據(jù)：骨折愈合需要足夠量的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的參入， 而在骨折初期，骨折局部只有少量的間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞 的增殖和分化，這是骨折愈合的前提和關(guān)鍵。因此增加骨折局部間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量成為 促進(jìn)骨折愈合的重要基礎(chǔ)。干細(xì)胞具有對(duì)組織損傷產(chǎn)生反應(yīng)，可遷徙、增殖分化并參入修復(fù) 過(guò)程。因此，骨折愈合早期是促進(jìn)骨折愈合的關(guān)鍵時(shí)期，在骨折愈合早期，骨折斷端在骨創(chuàng) 傷和適度應(yīng)力刺激的共同作用下，骨髓內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、周圍肌肉和血液的成體干 細(xì)胞，就會(huì)通過(guò)相應(yīng)的途徑向骨折處遷徙，這樣骨折局部可以募集較多數(shù)量的干細(xì)胞。本發(fā) 明采用適宜固定應(yīng)力的外固定架，建立了大鼠股骨干骨折斷端微動(dòng)模型，即大鼠應(yīng)力骨折 模型，采用剪切法分離骨折斷端組織中的細(xì)胞，簡(jiǎn)便易行，對(duì)細(xì)胞損傷很小。
[0007] 本發(fā)明技術(shù)方案為：首先建立外固定支架固定的大鼠應(yīng)力骨折模型，造模成功 后，在不同時(shí)點(diǎn)，取出骨折斷端組織，分離間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，用于研究骨折愈合早 期應(yīng)力環(huán)境對(duì)骨折斷端間充質(zhì)干細(xì)胞募集的影響，及對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的進(jìn)一步研究。
[0008] 所述的外固定支架包括4枚鋼針和2塊橫梁，4枚鋼針呈梳齒狀均勻排布在兩塊橫 梁之間，2塊橫梁由2枚鈦合金微型螺釘固定在一起；外固定支架軸向固定應(yīng)力為4. 5N/mm。
[0009] 所述的鋼針選用意大利Orphfix產(chǎn)品。鋼針的股骨接觸端直徑為0. 8mm，另一端直 徑為1. 2_ ;所述的橫梁，材料為高分子聚乙烯醫(yī)用材料，其剛度、彈性、韌性均符合生物力 學(xué)要求，且具有不遮擋x光線的特性和牢固固定鋼針的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)；所述的鈦合金微型螺釘 直徑為2. 6mm;所述的外固定支架長(zhǎng)、寬、高分別為20mm、5. 5mm、6mm。
[0010] 1本發(fā)明一種通過(guò)大鼠應(yīng)力骨折模型募集間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，步驟為： 1)建立大鼠應(yīng)力骨折模型 大鼠稱重后，3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，手術(shù)側(cè)股骨去毛備皮，消毒鋪巾， 手術(shù)在嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行，從股骨外側(cè)切口，自外側(cè)肌間隙暴露股骨，首先放置外固定支 架，外固定支架自股骨小粗隆至股骨髁上跨越股骨全長(zhǎng)，固定完成后，在內(nèi)側(cè)2個(gè)固定鋼針 之間用厚度1mm的微鋸橫行切斷股骨，沖洗刀口，用可吸收線縫合肌肉組織，用不可吸收 線縫合皮膚，手術(shù)后3天將大鼠的飲用水中加入12mg/500ml的鎮(zhèn)痛藥鹽酸曲馬多，手術(shù)前 30min及手術(shù)后3天皮下注射45mg/kg的克林霉素，防止細(xì)菌感染；手術(shù)完成后，大鼠自由 活動(dòng)，每天鋼釘處常規(guī)消毒； 2)細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng) 按步驟1)方法建立大鼠應(yīng)力骨折模型，分別于造模后第6、9、12、15、18天時(shí)，處死大 鼠，取出骨折斷端組織和健側(cè)股骨，按照下面方法分離細(xì)胞：取出的骨折斷端組織用磷酸緩 沖鹽溶液（PBS)漂洗2次，剪切至糊狀；用培養(yǎng)基反復(fù)輕輕吹打，使之穿過(guò)200目篩網(wǎng)，收 集遷移細(xì)胞（migratingcells，MCS)懸液，收集未濾過(guò)的材料，重復(fù)用培養(yǎng)基重懸，過(guò)濾，收 集合并遷移細(xì)胞懸液，離心后用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；按照以下的方法分離大鼠的骨髓細(xì)胞， PBS液沖出骨髓，收集骨髓細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml，按體積比1 : 1加入Ficoll 分離液，1800r/min離心20min，吸取界面單個(gè)核細(xì)胞，用PBS洗2次，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞， 將分離的骨髓細(xì)胞、遷移細(xì)胞濃度調(diào)整到IX106/ml，接種到多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中， 移入37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3天后全量更換新培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá) 80%?90%，即進(jìn)行傳代。
[0011] 所述的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。
[0012] 2觀察及評(píng)價(jià)方法 1)骨折斷端組織細(xì)胞計(jì)數(shù)：分別于造模后第6、9、12、15、18天時(shí)，處死大鼠，取出骨折 斷端組織和健側(cè)股骨，用D-Hanks液漂洗，剪切材料加入等量的DMEM培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色， 細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0013] 2)形態(tài)學(xué)觀察：在倒置顯微鏡（Olympus公司）下每日觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。
[0014] 3)細(xì)胞增殖曲線分析：將骨折斷端或骨髓來(lái)源的第3代細(xì)胞，以2X105cells/ml/ 孔接種在24孔板內(nèi)，每隔24h消化3個(gè)孔，收集細(xì)胞，并用0. 4%的臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞，繪制 生長(zhǎng)曲線。并按下式計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間：TD=tX[lgZ/GgNt-lgNd)]。Nt:收集細(xì)胞數(shù)；％: 接種細(xì)胞數(shù)；t:培養(yǎng)時(shí)間。
[0015] 4)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 成骨誘導(dǎo)分化：取骨折斷端或骨髓來(lái)源的第3代細(xì)胞，以105/孔的密度接種于6-fL板 中，待細(xì)胞融合80%，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)21d后，行茜素紅染色，并在倒置顯微鏡下 觀察染色情況。
[0016] 成軟骨誘導(dǎo)分化：取海綿或骨髓來(lái)源的第3代細(xì)胞，以105/孔的密度接種于6-fL 板中，待細(xì)胞融80%，加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)21d后，行阿辛藍(lán)染色，并在倒置顯微鏡 下觀察染色情況。
[0017] 成脂誘導(dǎo)分化：取骨折斷端或骨髓來(lái)源的第3代細(xì)胞，以105/孔的密度接種于 6-fL板中，待細(xì)胞融合90%，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)21d后，油紅0染色，并在倒置顯微 鏡下觀察染色情況。
[0018] 5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS17. 0軟件分析，利用 單向方差分析（One-wayANOVA)法進(jìn)行比較，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用X2 檢驗(yàn)。以P< 0. 05為差異有顯著性意義，P< 0. 01差異有非常顯著性意義。
[0019] 本發(fā)明提供的一種通過(guò)大鼠應(yīng)力骨折模型募集間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其有益效果 是： 1)通過(guò)建立大鼠應(yīng)力骨折模型，控制固定骨折處的力學(xué)環(huán)境，募集間充質(zhì)干細(xì)胞，促進(jìn) 骨折愈合，本方法操作簡(jiǎn)單，科學(xué)合理。
[0020] 2)驗(yàn)證了應(yīng)力微動(dòng)與細(xì)胞分子活動(dòng)之間的關(guān)系，可用于研究骨折愈合早期應(yīng)力 環(huán)境對(duì)骨折斷端間充質(zhì)干細(xì)胞募集的影響，以及用于間充質(zhì)干細(xì)胞分化等指標(biāo)的進(jìn)一步研 究，指導(dǎo)確定骨折早期安全有效的康復(fù)方案，通過(guò)適宜應(yīng)力募集更多間充質(zhì)干細(xì)胞的同時(shí)， 關(guān)節(jié)功能恢復(fù)正常。
[0021] 3)采用剪切法分離骨折斷端組織中的遷移細(xì)胞，簡(jiǎn)便易行，對(duì)細(xì)胞損傷很小，骨折 斷端組織中的細(xì)胞大部分可以被分離出