一種樹突狀細胞的制備方法、所得樹突狀細胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細胞免疫技術(shù)領(lǐng)域，特別一種樹突狀細胞的制備方法、所得樹突狀細 胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 細胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，使其數(shù)量成千倍增 多、靶向殺傷功能增強，然后再回輸?shù)饺梭w來殺滅血液及組織中的病原體、癌細胞、突變的 細胞，打破免疫耐受、激活和增強機體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。細胞免疫 治療具有副作用小、靶向治療、作用范圍更加廣泛等特點，在臨床研宄中備受關(guān)注。據(jù)報道， 經(jīng)過多個療程的細胞免疫治療，能夠有效殺除患者體內(nèi)腫瘤細胞，促進康復，改善患者的生 活質(zhì)量。樹突狀細胞療法是目前研宄最多的細胞免疫治療療法之一。
[0003] 樹突狀細胞（Dendriticcells，DC)是體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞（Antigen presentingcell，APC)，一方面，其能夠刺激初始的T細胞增殖，啟動免疫應答；另一方面， 樹突狀細胞還能夠呈遞抗原給MHC-I類限制性⑶8+和MHC-II類限制性⑶4 +T淋巴細胞，誘 導特異性免疫反應，被稱為"天然免疫佐劑"，因此，樹突狀細胞在誘導免疫應答中具有獨特 的地位。近年來，以DC細胞為基礎(chǔ)的免疫治療在臨床應用中得到越來越廣泛的關(guān)注，是國 內(nèi)外研宄的熱點。
[0004] 隨著研宄的深入，發(fā)現(xiàn)充足的DC細胞成為了DC細胞免疫治療研宄中的技術(shù)瓶頸。 現(xiàn)有的DC細胞制備方法中，大多采用抽取外周血培養(yǎng)，分離出造血干細胞，之后在多種細 胞因子存在下培養(yǎng)、誘導所得造血干細胞，制備獲得DC細胞。整個過程操作復雜，并且因為 細胞來源數(shù)量低、所得造血干細胞的數(shù)量也少，最終影響了DC細胞數(shù)量和質(zhì)量，導致治療 效果不理想。所以，十分有必要需找新的DC細胞的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供了一種樹突狀細胞的制備方法、所得樹突 狀細胞。本發(fā)明利用間充質(zhì)干細胞，成功制備獲得了樹突狀細胞，為樹突狀細胞的制備提供 了一種新的制備方法，且操作簡單，可用于樹突狀細胞的大量制備。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種樹突狀細胞的制備方法，其包括以下步驟：
[0008] 步驟1 :獲得間充質(zhì)干細胞；
[0009] 步驟2 :取所得間充質(zhì)干細胞，貼壁培養(yǎng)后，得貼壁細胞；
[0010] 步驟3 :培養(yǎng)、誘導所得貼壁細胞，收集樹突狀細胞。
[0011] 間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcells,MSC)，是一類多能干細胞，源于發(fā)育早 期的中胚層和外胚層。主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，由 于骨髓是其主要來源，因此統(tǒng)稱為骨髓間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞屬于非終末分化細胞， 它既有間質(zhì)細胞，又有內(nèi)皮細胞及上皮細胞的特征。間充質(zhì)干細胞在體外特定的誘導條件 下，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經(jīng)、肝、心肌、胰島0細胞和內(nèi)皮等多種組織細 胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。不論是自體還是同種異源的間充質(zhì) 干細胞，一般都不會引起宿主的免疫反應。由于間充質(zhì)干細胞具備的這種免疫學特性，使其 在自身免疫性疾病以及各種替代治療等方面具有廣闊的臨床應用前景。通過自體移植可以 重建組織器官的結(jié)構(gòu)和功能，并且可避免免疫排斥反應。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中 的間充質(zhì)干細胞為臍帶間充質(zhì)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞或脂肪間充質(zhì)干細胞。在本發(fā)明 的一些實施例中，本發(fā)明提供的制備方法中的間充質(zhì)干細胞為臍帶間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明 以間充質(zhì)干細胞為種子細胞，貼壁培養(yǎng)后，誘導所得貼壁細胞，即制備獲得樹突狀細胞，操 作簡單，可用于樹突狀細胞的大量制備。
[0012] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟3中的誘導所用誘導試劑包括第一誘導 試劑和第二誘導試劑；
[0013] 該第一誘導試劑包括GM-CSF、IL-4、胎牛血清和谷氨酰胺；
[0014]該第二誘導試劑包括TNF-a。
[0015]GM-CSF為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，是一種細胞因子。優(yōu)選地，本發(fā)明提供 的制備方法中，第一誘導試劑中GM-CSF的濃度100ng/mL?200ng/mL。在本發(fā)明的一些實施 例中，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導試劑中的GM-CSF的濃度為100ng/mL。在本發(fā)明 的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導試劑中的GM-CSF為rhGM-CSF。
[0016]IL-4為白細胞介素4,是一種細胞因子。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，第一 誘導試劑中IL-4的濃度為30ng/mL?50ng/mL。在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的 制備方法中，第一誘導試劑中的IL-4的濃度為30ng/mL。在本發(fā)明的另外一些實施例中，本 發(fā)明提供的制備方法中，IL-4為rhIL-4。
[0017] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導試劑中胎牛血清的濃度為10%。
[0018] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導試劑中，谷氨酰胺的濃度為2mmol/L?4mmol/L。在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導試劑中，谷氨 酰胺的濃度為2mmol/L。
[0019] TNF-a是一種腫瘤壞死因子。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，第二誘導試劑 中，TNF-a的濃度為500UI/mL?150〇n/mL。在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的制 備方法中，第二誘導試劑中，TNF-a的濃度為l〇〇〇n/mL。
[0020] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟3中培養(yǎng)、誘導包括：
[0021] 向所得貼壁細胞中加入含第一誘導試劑的培養(yǎng)液，培養(yǎng)；在補加含第一誘導試劑 的培養(yǎng)液之后，再加入含第二誘導試劑的培養(yǎng)液；之后，進行檢測，收集樹突狀細胞，即得。
[0022] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟3中所述培養(yǎng)、誘導具 體為：
[0023] 向所得貼壁細胞中加入含第一誘導試劑的培養(yǎng)液，培養(yǎng)；
[0024]在培養(yǎng)的第三天補加半量該含第一誘導試劑的培養(yǎng)液；
[0025]在培養(yǎng)的第六天，半量離心，補加含第二誘導劑的培養(yǎng)液，
[0026] 在培養(yǎng)的第七天，進行檢測，收集樹突狀細胞，即得。
[0027]在本發(fā)明的一些實施例中，所述收集樹突狀細胞為：將誘導并促熟后的DC細胞離 心清洗后吸去上清，加入lmL細胞凍存液，混勻后凍存于2mL的凍存管中，置于凍存盒中，放 入-80 °C冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮保存；所述細胞凍存液包括20%人血白蛋白、無血清培養(yǎng)基和DMSO,所述20%人血白蛋白、無血清培養(yǎng)基和DMSO的體積比為5:4:1。
[0028] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟1中獲得間充質(zhì)干細 胞的方法具體為：
[0029] 獲得沃爾頓膠，種植于含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)液中，組織塊貼壁法培養(yǎng)，即獲得間充質(zhì) 干細胞。
[0030] 間充質(zhì)干細胞的制備方法優(yōu)選但不限定為本發(fā)明提供的制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以根據(jù)實際情況選擇制備間充質(zhì)干細胞的方法。
[0031] 本發(fā)明提供了一種樹突狀細胞的制備方法、所得樹突狀細胞。本發(fā)明提供的樹突 狀細胞的制備方法包括：獲得間充質(zhì)干細胞；取所得間充質(zhì)干細胞，貼壁培養(yǎng)后，得貼壁細 胞；培養(yǎng)、誘導所得貼壁細胞，收集樹突狀細胞。本發(fā)明提供的制備方法利用間充質(zhì)干細胞 作為種子細胞，貼壁培養(yǎng)后，誘導所得貼壁細胞，即制備獲得樹突狀細胞，操作簡單，可用于 樹突狀細胞的大量制備，使該制備方法更利于推廣和應用。實驗結(jié)果證實，本發(fā)明提供的制 備方法成功制備獲得了樹突狀細胞，所得樹突狀細胞與常規(guī)方法所得樹突狀細胞相比，形 態(tài)及功能上并無差異，說明該方法可用于樹突狀細胞的大量制備。
【附圖說明】
[0032] 圖1示實施例2所得間充質(zhì)干細胞細胞分析結(jié)果；其中，圖1-A為間充質(zhì)干細胞的 流式圖；圖1-B為間充質(zhì)干細胞的倒置顯微鏡下形態(tài)圖；
[0033] 圖2示實施例2中所得樹突狀細胞的流式細胞分析結(jié)果；其中，DC代表樹突狀細 胞；
[0034] 圖3示實施例2中所得樹突狀細胞的HLA-DR+CD86+的流式細胞分析結(jié)果；
[0035] 圖4示實施例2中所得樹突狀細胞的⑶83+CD86+的流式細胞分析結(jié)果；
[0036] 圖5示實施例2中所得