從菠蘿皮中分離純化菠蘿蛋白酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程中反膠束萃取技術(shù)領(lǐng)域，也涉及菠蘿皮的回收利用技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，科學(xué)家們利用表面活性劑在溶液中形成的各種分子有序組合體(如膠束、 反膠束、微乳液、液晶以及囊泡等）作為反應(yīng)介質(zhì)或模板，有效地對納米粒子的大小和形貌 進行調(diào)控，其中作為微反應(yīng)器的反膠束是在非極性溶劑中形成的，它特殊的納米空間一 "水池"能將一些親水性的物質(zhì)，如酶和蛋白質(zhì)等增溶于其中，為它們提供一個特殊的微環(huán) 境。
[0003] 菠蘿蛋白酶是典型的巰基蛋白酶，廣泛存在于菠蘿的果實、芽、葉、莖中，分子量為 33000,能分解蛋白質(zhì)、肽、酯和酰胺。它水解蛋白的活性較木瓜蛋白酶高十倍以上，因此可 廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域。譬如在生物化工中可將其用于干酪、明膠、水解蛋白的 生產(chǎn)，在食品工業(yè)中將其作為一種食品添加劑，可使肉質(zhì)嫩化、啤酒澄清；在醫(yī)藥工業(yè)中，由 于它能在生物體內(nèi)溶解纖維蛋白和血凝塊，因此可以治療水腫及多種炎癥，并使患處迅速 溶痂，此外，菠蘿蛋白酶對正常組織無害，不影響植皮，適用于中小面積深度燒傷的治療。
[0004]目前，用于工業(yè)化生產(chǎn)、提取菠蘿蛋白酶的方法主要有三種：高嶺土吸附法、單寧 沉淀法、超濾濃縮法；但這三種方法不僅生產(chǎn)成本高昂、易造成環(huán)境污染、生產(chǎn)工藝和操作 復(fù)雜，而且所得酶活性也不足以滿足醫(yī)藥級別及食品中對酶活性要求較高的應(yīng)用。
[0005] 另一方面，我國雖然菠蘿資源豐富，年產(chǎn)量在140萬噸以上，而在用于加工菠蘿罐 頭、果汁等食品上，采用的完全是菠蘿果肉部分，剩下的菠蘿皮、菠蘿莖等部分就被作為廢 棄物而扔掉，這樣不僅造成了資源的浪費，而且也污染環(huán)境。
[0006] 鑒于反膠束的獨特結(jié)構(gòu)及其對酶的功能或者活性影響較小等特點，CTAB(十六烷 基三甲基溴化銨）/異辛烷/正丁醇/正己醇反膠束曾被用來從菠蘿皮中分離純化菠蘿蛋 白酶，但表面活性劑CTAB用量較大，為0. 055g/mL，可實際應(yīng)用的萃取條件窄，所得菠蘿蛋 白酶的萃取效率和活性回收率較低，最佳萃取條件下，萃取效率和活性回收率分別為40% 和 78%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的是提出一種從廢棄的菠蘿皮中分離純化菠蘿蛋白酶的方法，以提高菠 蘿產(chǎn)業(yè)的增值。
[0008] 本發(fā)明包括以下步驟： 1) 制備菠蘿蛋白酶粗提液：將干凈的菠蘿皮與pH值為6. 0的磷酸緩沖溶液混合于粉 粹機中粉粹，4°C下離心，取上清液，即粗酶液； 2)前萃?。簩aCl、NaBr或KBr含量為0. 05~0. 25 M、pH值為8.0?12的甘氨酸-氫 氧化鈉緩沖液與粗酶液混合后再與反膠束以等體積比混合振蕩后，經(jīng)離心分離取上層有機 相；所述反膠束由十二烷基三甲基溴化銨（DTAB)、正己烷、正己醇和水混合組成；十二烷基 三甲基溴化銨在反膠束中的濃度為0. 〇〇8g/ml?0. 025g/ml; 3) 后萃?。簩Br、NaBr或NaCl濃度為 0? 25~1. 5M、pH值為 4. 2 ?6. 0 的HAC-NaAC 緩沖液或pH值為5. 0?8. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液與有機相等體積比混合振 蕩后，經(jīng)離心分離取下層水相； 4) 冷凍干燥：將下層水相在壓強為50±2Pa、溫度為-60°C?_55°C下冷凍干燥，得到純 菠蘿蛋白酶。
[0009] 本發(fā)明前萃取是用反膠束萃取菠蘿蛋白酶粗提液，使菠蘿蛋白酶進入反膠束中， 離心分離后取有機相；后萃取是用后萃液(亦稱反提取劑）萃取有機相，使反膠束中的菠蘿 蛋白酶從反膠束轉(zhuǎn)移到水相中，離心分離后得到菠蘿蛋白酶溶液。
[0010] 本發(fā)明充分利用了廢棄的菠蘿皮，不但可以改善環(huán)境，同時也可提高菠蘿產(chǎn)業(yè)的 增值。本發(fā)明突破傳統(tǒng)提取和分離菠蘿蛋白酶的方法，實現(xiàn)從菠蘿皮中高效提取菠蘿蛋白 酶，保持菠蘿蛋白酶的活性，減少菠蘿蛋白酶的損失，提高菠蘿廢棄物的綜合利用，加快菠 蘿及其蛋白酶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0011] 本發(fā)明采用單鏈的十二烷基三甲基溴化銨作為反膠束主成分，其用量小，十二烷 基三甲基溴化銨在反膠束中的濃度只占0. 〇〇8g/ml?0. 025g/ml，不但能減少對菠蘿蛋白 酶的污染，還可使菠蘿蛋白酶的提取效應(yīng)達到最佳；萃取分離以后，反膠束相與水相分層明 顯，在萃取過程中保持了菠蘿蛋白酶的活性，減少了菠蘿蛋白酶的損失。萃取條件范圍廣， 操作過程簡單，提取工藝易于放大，萃取以后，菠蘿蛋白酶的萃取效率達到56%，活性回收率 達到95%，純化倍數(shù)達到1. 7。
[0012] 另外，本發(fā)明十二烷基三甲基溴化銨在所述反膠束中的濃度為〇.〇15g/ml? 0. 025g/ml。在此條件下的菠蘿蛋白酶萃取效率、活性回收率和純化倍數(shù)達到實際生產(chǎn)的較 佳要求。
[0013] 本發(fā)明反膠束中的助溶劑正己醇的存在一方面是為了配置得到穩(wěn)定的反膠束，另 一方面可調(diào)控反膠束的體積和表面活性劑與酶的相互作用，從而促使酶由水相轉(zhuǎn)移至反膠 束相。優(yōu)選的正己醇占正己烷和正己醇混合總體積的9. 5?11. 1%。
[0014] 本發(fā)明所述pH值為6. 0的磷酸緩沖溶液中包含5mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA)，磷酸緩沖溶液的濃度為0. 04mol/L。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA)具有活性保護劑和 抗氧化劑的作用，可保持菠蘿蛋白酶的活性。
[0015] 為了有利于菠蘿蛋白酶從菠蘿皮中被浸提出來，并可保持菠蘿皮中菠蘿蛋白酶的 活性，防止菠蘿蛋白酶的自身水解作用，通常磷酸緩沖溶液與菠蘿皮的混合質(zhì)量比為1:1。
[0016] 所述前萃取中甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液的pH值為9.0?11。菠蘿皮中菠蘿蛋白 酶的等電點為9. 5,當(dāng)水相pH值大于酶的等電點時，酶所帶電荷與反膠束內(nèi)表面所帶電荷 相反。酶和表面活性劑之間的靜電吸引作用可使酶萃取到反膠束中。水相pH值也決定了 酶表面可電離基團的離子化程度。水相pH值越高，目標酶所帶負電荷越多，它和陽離子表 面活性劑之間的靜電吸引作用就越強，有利于酶的前萃取。因此為了提高菠蘿蛋白酶最佳 的萃取效率和活性回收率，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液的pH值為9. 0?11。
[0017] 適量鹽的存在可減少表面活性劑頭基間的靜電斥力，增強酶與表面活性劑頭基之 間的相互作用。但鹽的濃度過大，則會屏蔽表面活性劑和酶之間的靜電作用，不利于酶的提 取。本發(fā)明在前萃取中，NaCl、NaBr或KBr在pH值為8.0?12的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖 液中的濃度為0. 1 M。該離子強度對萃取效率、活性回收率和純化倍數(shù)的提高都具有較好的 貝獻。
[0018] 前萃取中，所述甘氨酸_氫氧化鈉緩沖液和粗酶液的混合體積比為24?50:1。待 提取粗酶液中酶的含量也是決定反膠束提取效應(yīng)的一個重要因素。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在該條件 下，菠蘿蛋白酶可表現(xiàn)良好的活性回收率和萃取效率。
[0019] 為了提高萃取效率、活性回收率及純化倍數(shù)，后萃取中，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉 緩沖液的pH值優(yōu)選為6.0?8.0。后萃取中，當(dāng)pH值小于酶的等電點時，表面活性劑與酶 相互排斥，促使酶從反膠束內(nèi)核中排出。因此緩沖液的pH值一定要小于菠蘿蛋白酶的等電 點9. 5。并且后萃取中，KBr或NaBr1濃度優(yōu)選為0. 5M。
[0020] 后萃取中，優(yōu)選pH值為4. 2?5. 0的HAC-NaAC緩沖液，其中KBr或NaBr濃度為 0. 5?1. 0M，或采用pH值為4. 2?5. 0的HAC-NaAC緩沖液中NaCl濃度為0. 25M兩種方案 都利于提高菠蘿蛋白酶萃取效率、活性回收率及純化倍數(shù)。
[0021] 本發(fā)明在后萃取中，HAC-NaAC緩沖液的pH值優(yōu)選為4. 2,菠蘿蛋白酶萃取效率、活 性回收率及純化倍數(shù)可達到最大值。
【附圖說明】
[0022] 圖1為菠蘿蛋白酶萃取效率以及活性回收率、純化倍數(shù)與表面活性劑DTAB濃度的 變化關(guān)系圖。
[0023] 圖2為菠蘿蛋白酶萃取效率以及活性回收率、純化倍數(shù)與前萃取時甘氨酸-氫氧 化鈉緩沖液pH值的變化關(guān)系圖。
[0024] 圖3為菠蘿蛋白酶萃取效率以及活性回收率、純化倍數(shù)與后萃取時HAC-NaAC緩沖 液或磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的pH值的變化關(guān)系圖。
[0025] 圖4為菠蘿蛋白酶萃取效率以及活性回收率、純化倍數(shù)與反膠束中正己醇占正己 烷和正己醇混合比的變化關(guān)系圖。
[0026] 圖5為菠蘿蛋白酶萃取效率與前萃取時加入的三種鹽濃度的變化關(guān)系圖。
[0027] 圖6為菠蘿蛋白酶活性回收率與前萃取時加入的三種鹽濃度的變化關(guān)系圖。
[0028] 圖7為菠蘿蛋白酶純化倍數(shù)與前萃取時加入的三種鹽濃度的變化關(guān)系圖。
[0029] 圖8為菠蘿蛋白酶萃取效率與后萃取時加入的三種鹽濃度的變化關(guān)系圖。
[0030] 圖9為菠蘿蛋白酶活性回收率與后萃取時加入的三種鹽濃度的變化關(guān)系圖。
[0031] 圖10為菠蘿蛋白酶純化倍數(shù)與后萃取時加入的三種鹽濃度的變化關(guān)系圖。
[0032] 圖11為菠蘿蛋白酶萃取效率以及活性回收率、純化倍數(shù)與菠蘿蛋白酶粗提液稀 釋倍數(shù)的變化關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0033] 一、分離純化工藝： 1、反膠束配制： 稱取一定量的十二烷基三甲基溴化銨（DTAB)，并加入到按體積比11:1?4:1混合的正 己烷和正己醇的混合體系中，按(表面活性劑分子和水分子的摩爾比）=20:1加入蒸餾 水，然后用振蕩器充分振蕩至得到澄清透明的溶液，此即為反膠束。
[0034] 以此配成各反膠束中DTAB占比分別為0. 003g/ml?0. 035g/ml，且，正己醇占正己 烷和正己醇混合體積百分數(shù)8. 3%?20%。
[0035] 2、酶粗液的提?。?a.預(yù)處理：將菠蘿皮在清水中洗凈，浙干，切成小段后置于-20°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br>[0036]b.粗酶液的抽提：解凍原料--菠蘿皮后，將菠蘿皮與相同質(zhì)量的0. 04mol/L、 PH6.0磷酸(含5mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉（EDTA))緩沖溶液置于粉粹機中粉粹；之后 用四層紗布擠壓進行渣汁分離，得到的粗濾液在4°C下lOOOOrpm離心25min后，取上清 液，即粗酶液。
[0037] 3、前萃?。?按常規(guī)方法，用甘氨酸和氫氧化鈉配置50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH值范圍為8.0?12。再加入NaCl、NaBr或KBr，使甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中的NaCl、NaBr或KBr 濃度為〇?0.35M后，再以體積比10:1?50:1的比例加入粗酶液。
[0038]再將上述混合溶液與反膠束等體積混合，充分振蕩15min，在25°C，14000rpm下離 心45min，得到兩相，上層為反膠束相，下層為水相。
[0039] 4、后萃?。?后萃液配置：按常規(guī)方法，用醋酸和醋酸鈉配置10mMHAC-NaAC緩沖液，pH值范圍為 3. 6?6. 0 ;或用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配置10mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH值 范圍為5.0?8.0?；蛴肗aCl、NaBr或KBr使HAC-NaAC緩沖液中的NaCl、NaBr或KBr濃 度為0.25?2.0M?；蛴肗aCl、Na