一種親和層析分段洗脫純化糜蛋白酶的方法及含有糜蛋白酶的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種應(yīng)用多重結(jié)晶、活化、鹽析、透析、親和層析等純化糜蛋白酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糜蛋白酶又稱胰凝乳蛋白酶，分子量為42000道爾頓，用于肽鏈的酶解，專門水解肽鍵，屬于肽鏈內(nèi)切酶，水解產(chǎn)率很高，但其專一性小于胰蛋白酶。其固體狀態(tài)較穩(wěn)定，呈白色棒狀結(jié)晶；而水溶液極不穩(wěn)定，pH在5?8時，其活力最強，也最易失去活性。
[0003]糜蛋白酶為胰腺分泌的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質(zhì)，作用、用途與胰蛋白酶相似，比胰蛋白酶分解能力強、毒性低、不良反應(yīng)小。一般用于手術(shù)后創(chuàng)口或創(chuàng)傷愈合、抗炎及防止局部積血、水腫、扭傷血腫、乳房手術(shù)后局部腫脹、鼻炎、中耳炎等。也可用于白內(nèi)障摘除、松解睫狀肌韌帶，以減少膜破裂和視網(wǎng)膜損傷。此外，糜蛋白酶與胰蛋白酶或其他化學(xué)藥劑共同治療各種炎癥具有協(xié)同作用，故常用于外科創(chuàng)傷及眼睛消腫治療。
[0004]本發(fā)明人自2008年開始對糜蛋白酶的生產(chǎn)工藝進(jìn)行試驗研究，特別是在生產(chǎn)過程中，不斷探索，通過改變條件的多重結(jié)晶，使糜蛋白酶效價高達(dá)1500?1800iu/mg,生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種親和層析分段洗脫純化糜蛋白酶的方法及含有糜蛋白酶的藥物組合物，是為了解決糜蛋白酶提取工藝蛋白活性損失嚴(yán)重的缺點，通過改變結(jié)晶條件進(jìn)行多重結(jié)晶，結(jié)合超濾、透析、親和層析純化糜蛋白酶，較好的保持蛋白活性。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
一種親和層析純化糜蛋白酶的方法，其特征在于:改變結(jié)晶條件進(jìn)行多重結(jié)晶，結(jié)合超濾、透析、親和層析等現(xiàn)代生物分離技術(shù)，將糜蛋白酶效價提高到1500?1800iu/mg，更好的保持了蛋白的活性。在發(fā)明技術(shù)方案中，其特征還在于所述提取工藝包括如下步驟:
O多重結(jié)晶 1.1)結(jié)晶I
核對糜蛋白酶原重量，加糜蛋白酶原重量7倍(w/v)純化水?dāng)嚢枞芙?，加入少許硫酸攪拌，調(diào)節(jié)pH值至2.5?3.5 ;按2倍糜蛋白酶原重量(w/v)加入飽和硫酸銨溶液，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至4.5?5.5，置于25°C條件下，保溫，過濾，收集濾餅；
1.2)結(jié)晶II
加濾餅重量3倍量(w/v)的純化水溶解，調(diào)節(jié)pH值至2.5?3.5 ;加濾餅重量I倍量(w/v)飽和硫酸銨溶液，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至4.5?5.5，置于25°C條件下，保溫，過濾，收集濾餅；
1.3)結(jié)晶III 加濾餅重量3倍量(w/v)的純化水溶解，調(diào)節(jié)pH值至2.5?3.5 ;加濾餅重量I倍量(w/v)飽和硫酸銨溶液，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至4.5?5.5，置于25°C條件下，保溫，過濾，收集濾餅，濾液作母液回收；
1.4)母液回收III
量取母液體積，調(diào)節(jié)pH值至2.5?3.5，按硫酸銨:母液=305g: IL的比例，加入固體硫酸銨，攪拌溶解；1.5)結(jié)晶IV
加濾餅重量3倍量(w/v)的純化水溶解，調(diào)節(jié)pH值至2.5?3.5 ;加濾餅重量I倍量(w/v)飽和硫酸銨溶液，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至4.5?5.5，置于25°C條件下，保溫，過濾，收集濾餅，濾液作母液回收；
1.6)母液回收IV
量取母液體積，調(diào)節(jié)pH值至2.5?3.5，按硫酸銨:母液=305g: IL的比例，加入固體硫酸銨，攪拌溶解；
2)活化
稱量濾餅重量，加3倍量純化水溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.0?9.0 ;加入濾餅重量I倍量的(w/v)磷酸緩沖液，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至7.0?9.0。加入胰蛋白酶活化，置于冰箱中，兩天后調(diào)節(jié)PH值至7.0?9.0 ;
3)鹽析
活化液調(diào)節(jié)PH值至3.0?5.0，加入固體硫酸銨，靜置過夜，次日過濾，收集濾餅；
4)超濾
加入濾餅重量15倍量的(w/v)磷酸鹽緩沖液，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至7.0?9.0，待液體超濾，體積控制在3/10 ；
5)熱原處理
5.1)取超濾液，按50:5:3的比例，先后加入磷酸鈉溶液和醋酸鈣溶液；
5.2)調(diào)節(jié)pH值至8.0?10.0，攪拌，離心，棄去沉淀物，取濾液，準(zhǔn)備透析扎包；
6)透析工序
取濾液，透析液扎包，放入純化水中，進(jìn)行透析交換，透析4?6天；
7)親和層析
7.1)用適量的含 0.5-3mol/L (NH4)2SO4的 0.01-0.3mol/L, PH3-8 的 NaAc-HAc 緩沖液平衡親和層析快膠柱；
7.2)將透析液流經(jīng)此柱，流速控制在l~5mL/min左右；
7.3)平衡后，用0.5-3!1101/1的(NH4)2SCV^液洗脫至蛋白檢測儀顯示至基線；
7.4)再用不含(NH4)2SOJ衡緩沖液洗脫，收集含糜蛋白酶活性峰的洗脫液，-20°C保存；
8)凍干
調(diào)節(jié)pH值至5.5?6.5，裝盤、凍干，得糜蛋白酶。
[0007]經(jīng)檢測，所得糜蛋白酶效價約為1500?1800iu/mg。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
選用改變條件的多重結(jié)晶，結(jié)合超濾、透析、親和層析等現(xiàn)代生物分離技術(shù)純化糜蛋白酶，可以使其理化性質(zhì)和生物活性在后續(xù)生產(chǎn)過程中保持穩(wěn)定，最終使糜蛋白酶的各項指標(biāo)均符合中國藥典標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，通過工藝的不斷改進(jìn)和完善，使得糜蛋白酶效價提高到1500?1800iu/mg,節(jié)約成本,提高了經(jīng)濟效益。
【具體實施方式】
[0009]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，而不以任何方式限制。
[0010]實施例1 O多重結(jié)晶 1.1)結(jié)晶I
將30kg糜蛋白酶原投入反應(yīng)罐中，加入21L純化水?dāng)嚢枞芙?，?.5mol/L硫酸500mL攪拌8小時后，再用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值至2.5 ;加入飽和硫酸銨溶液60L，攪拌15分鐘，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至4.5，置于25°C條件下，恒溫48小時后過濾，收集濾餅23.6kg ；
1.2)結(jié)晶II
將所得濾餅投入反應(yīng)罐中，加70.8L純化水?dāng)嚢枞芙鉃V餅，用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值至3.0 -M 23.6L飽和硫酸銨溶液，攪拌15分鐘，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.0，置于25°C條件下，恒溫24小時后過濾，收集濾餅20.5kg ；
1.3)結(jié)晶III
將所得濾餅投入反應(yīng)罐中，加61.5L純化水?dāng)嚢枞芙鉃V餅，用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值至3.5 ;加20.5L飽和硫酸銨溶液，攪拌15分鐘，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.5，置于25°C條件下，恒溫24小時后過濾，收集濾餅15.4kg,濾液作母液回收；
1.4)母液回收III
量取母液體積84.3L，用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值至2.5，加入固體硫酸銨25.71kg，攪拌溶解，靜置過夜，次日過濾，收集濾餅2.4kg ；1.5)結(jié)晶IV
合并所得濾餅投入反應(yīng)罐中，加53.4L純化水?dāng)嚢枞芙鉃V餅，用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值至2.5 ;加17.8L飽和硫酸銨溶液，攪拌15分鐘，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.0,置于25°C條件下，恒溫24小時后過濾，收集濾餅13.3kg，濾液作母液回收；
1.6)母液回收IV
量取母液體積71.9L，用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值至3.5，加入固體硫酸銨21.93kg，攪拌溶解，靜置過夜，次日過濾，收集濾餅2.1kg ；
2)活化
合并所得濾餅投入反應(yīng)罐中，加46.2L純化水溶解，加2.5mol/L硫酸助溶，用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0 ;加入15.4L磷酸緩沖液，攪拌10分鐘，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5，得料液62.5L。加入胰蛋白酶晶體12.5g，置于4°C冰箱中，兩天后用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，得活化液59.2L ；
3)鹽析
上述活化液用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值至4.0,加入固體硫酸銨29.6kg，靜置過夜，次日過濾,收集濾餅12.4kg ；
4)超濾將所得濾餅投入反應(yīng)罐中，加入磷酸鹽緩沖液186L，攪拌10分鐘，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.5，待液體超濾，體積控制在3/10，得超濾液188L;
5)熱原處理
5.1)取上述超濾液，按50:5:3的比例，先加入0.4mol/L磷酸鈉溶液18.8L，在不斷攪拌下緩緩加入lmol/L醋酸鈣溶液11.28L;
5.2)用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至9.0,穩(wěn)定后繼續(xù)攪拌1.5小時，結(jié)束后，離心20分鐘，棄去沉淀物，得濾液180L;
6)透析工序
取上述濾液，透析液扎包(10mL/包)，將透析袋放入4°C純化水中，進(jìn)行透析交換5天，每24小時換一次純化水；
7)親和層析
7.1)用 66L 的含 1.5mol/L (NH4)2