改良型腈水合酶的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?01280028338. 7(國際申請?zhí)枮镻CT/JP2012/003745)的原申 請的分案申請，該原申請的申請日為2012年6月7日，發(fā)明名稱為"改良型腈水合酶"。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及改良型（變異型）腈水合酶及其制造方法。進而涉及編碼該酶的基 因DNA、包含該基因DNA的重組載體、和具有該重組載體的轉(zhuǎn)化體以及酰胺化合物的制造方 法。
【背景技術】
[0003] 近年發(fā)現(xiàn)了酶腈水合酶、即具有將腈基水合并轉(zhuǎn)換為酰胺基的腈水合活性的酶， 公開了使用該酶或含有該酶的微生物菌體等通過腈化合物而制造對應的酰胺化合物的方 法。已知該制造方法與現(xiàn)有的化學合成法相比較，由腈化合物向?qū)孽０坊衔锏霓D(zhuǎn)化 率和選擇率高。
[0004] 作為生產(chǎn)腈水合酶的微生物，可列舉出例如：屬于棒狀桿菌屬 (Corynebacterium)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、紅球菌屬（Rhodococcus)、根瘤菌屬 (Rhizobium)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia)等的微生物。 其中，玫瑰色紅球菌（Rhodococcusrhodochrous)Jl株用于丙稀酰胺的工業(yè)生產(chǎn)中，其有用 性已被證實。另外，編碼該菌株所產(chǎn)生的腈水合酶的基因也已明確（參照專利文獻1)。
[0005] 另一方面，不僅利用由自然界中存在的微生物分離的腈水合酶、其基因，還出于 改變腈水合酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、對底物的穩(wěn)定性、對生成物的穩(wěn)定 性等目的，嘗試了向腈水合酶中導入變異；嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶中，由立體 結(jié)構(gòu)信息預測與底物特異性、熱穩(wěn)定性相關的區(qū)域，從中取得底物特異性變化了的變異酶 (參照專利文獻2?4)。另外，本發(fā)明人等得到耐熱性或酰胺化合物耐性均提高了的腈水 合酶基因（參照專利文獻5?9)。
[0006] 在利用酶法工業(yè)生產(chǎn)丙烯酰胺方面，從催化劑成本等生產(chǎn)成本的觀點等出發(fā)，開 發(fā)催化活性提高的腈水合酶是非常有用的；從反應時的酶量的削減和成本削減等觀點出 發(fā)，尤其期望開發(fā)而獲得活性提高了的酶。
[0007] 現(xiàn)有技術文獻
[0008] 專利文獻
[0009] 專利文獻1:日本專利第3162091號公報
[0010] 專利文獻2 :國際公開第2004/056990號小冊子
[0011] 專利文獻3 :日本特開2004-194588號公報
[0012] 專利文獻4 :日本特開2005-16403號公報
[0013] 專利文獻5:國際公開第2005/116206號小冊子
[0014] 專利文獻6:日本特開2007-143409號公報
[0015] 專利文獻7:日本特開2007-43910號公報
[0016] 專利文獻8:日本特開2008-253182號公報
[0017] 專利文獻9:日本特開2010-172295號公報

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 發(fā)明要解決的問題
[0019] 因此，本發(fā)明的目的在于，通過腈水合酶的改良提供催化活性提高了的改良型腈 水合酶。另外，本發(fā)明的目的在于提供編碼該改良型腈水合酶的DNA、包含該DNA的重組載 體、包含該重組載體的轉(zhuǎn)化體、從該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中提取的腈水合酶及其制造方法。進 一步，本發(fā)明的目的在于提供使用了該培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物的酰胺化合物的制造方 法。
[0020]用于解決問題的方案
[0021] 本發(fā)明人等為了解決上述問題進行了深入的研宄。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在野生型腈水合酶 的氨基酸序列中將特定的氨基酸殘基置換為其他的氨基酸殘基而成的蛋白質(zhì)不僅具有腈 水合酶活性，催化活性也提高了；至此完成本發(fā)明。
[0022] 即，本發(fā)明如下。
[0023] (1) 一種改良型腈水合酶，其具有選自下述（a)?（e)中的至少一種特征。
[0024] (a) -種改良型腈水合酶，其特征在于，其為0亞基中包含序列號50所示的氨基 酸序列的腈水合酶；
[0025]GX1X2X3X4DX5X6R( 50)
[0026] G表不甘氨酸，D表不天冬氨酸，R表不精氨酸，XpX2、X3、X5、乂6分別獨立地表不任 意的氨基酸殘基；
[0027]X4為選自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天 冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸所組成的組的氨基酸。
[0028] (b) -種改良型腈水合酶，其特征在于，其為0亞基中包含序列號81所示的氨基 酸序列的腈水合酶；
[0029] ffEX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18D( 81)
[0030]W表不色氨酸，E表不谷氨酸，D表不天冬氨酸，Xi?X6和X8?X18表不分別獨立 的任意的氨基酸殘基；
[0031] &為選自由丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸所 組成的組的氨基酸。
[0032] (c) 一種改良型腈水合酶，其特征在于，其為a亞基中包含序列號119所示的氨基 酸序列的腈水合酶；
[0033] AXiXJsXfXsXeGXJs(序列號119)
[0034] A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，X7表示分別獨立的任意的氨基酸殘基；
[0035] &為選自由丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯 丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸所組成的組的氨 基酸。
[0036] (d) -種改良型腈水合酶，其特征在于，其為a亞基中包含序列號132所示的氨基 酸序列的腈水合酶；X7被置換為不同于野生型的氨基酸；
[0037]AX1X2X3X4GX 5X6GX7Q(j^^!j^ 132)
[0038]A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，Q表示谷氨酰胺，&?乂6表示分別獨立的任意的氨 基酸殘基；
[0039] (e) -種改良型腈水合酶，其特征在于，其為a亞基中包含序列號136所示的氨基 酸序列的腈水合酶；X9被置換為不同于野生型的氨基酸；
[0040] AX1X2X3X4GX 5X6GX7QX8X9(j^^!j^ 136)
[0041]A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，Q表示谷氨酰胺，Xi?X8表示分別獨立的任意的氨 基酸殘基。
[0042] (2)根據(jù)（1)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號50的X2*S(絲氨酸）。
[0043] (3)根據(jù)（1)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號50的XiSl(異亮氨 酸），乂2為S(絲氨酸），X3為W(色氨酸），X5為（K賴氨酸），X6為S(絲氨酸）。
[0044] (4)根據(jù)⑴?（3)的任一項所述的改良型腈水合酶，包含前述序列號50所示的 氨基酸序列的腈水合酶具有序列號51所示的氨基酸序列。
[0045] (5)根據(jù)⑴所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號81的X14SG(甘氨酸）。
[0046] (6)根據(jù)⑴所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號81的&為6(甘氨酸）， 父 2為R(精氨酸），X3為T(蘇氨酸），X4為L(亮氨酸），X5為S(絲氨酸），X6為I(異亮氨 酸），乂8為T(蘇氨酸），X9為W(色氨酸），X1(|為M(甲硫氨酸），X^為H(組氨酸），X12為 L(亮氨酸），X13SK(賴氨酸），X14為G(甘氨酸）。
[0047](7)根據(jù)（1)、（5)和（6)的任一項所述的改良型腈水合酶，包含前述序列號81所 示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列號82所示的氨基酸序列。
[0048] (8)根據(jù)⑴所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號119的X$M(甲硫氨 酸），乂2為A(丙氨酸），X3為S(絲氨酸），X4為L(亮氨酸），X5為Y(酪氨酸），X6為A(丙 氨酸），&為E(谷氨酸）。
[0049] (9)根據(jù)⑴或⑶所述的改良型腈水合酶，包含前述序列號119所示的氨基酸序 列的腈水合酶具有序列號120所示的氨基酸序列。
[0050] (10)根據(jù)（1)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，其為a亞基中包含序列號 132所示的氨基酸序列的腈水合酶；X7為選自由半胱氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴 氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、蘇氨酸、酪氨酸所組成的組的氨基酸。
[0051] (11)根據(jù)⑴或（10)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號132的&為 M(甲硫氨酸），乂2為A(丙氨酸），X3為S(絲氨酸），X4為L(亮氨酸），X5為Y(酪氨酸），X6 為A(丙氨酸）。
[0052] (12)根據(jù)（1)、（10)和（11)的任一項所述的改良型腈水合酶，包含前述序列號 132所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列號131所示的氨基酸序列。
[0053] (13)根據(jù)（1)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，其為a亞基中包含序列號 136所示的氨基酸序列的腈水合酶，X9為選自由半胱氨酸