胰蛋白酶消化液、制備方法及即用型痰消化裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于痰消化液領(lǐng)域，具體地，涉及一種胰蛋白酶消化液、制備方法及即用型 痰消化裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 痰消化液是一種用于消化痰標(biāo)本、使痰液液化的試劑。作為一種輔助試劑，主要目 的是使痰標(biāo)本液化，均質(zhì)化，使一些含量較低被包裹在黏蛋白中的致病菌能夠釋放到溶液 中，提高致病菌的檢出率，使檢驗(yàn)醫(yī)師在痰涂片和痰培養(yǎng)過(guò)程中，能夠有更好的檢出效果。
[0003]目前臨床上痰液消化主要有兩種途徑：1.作用于蛋白質(zhì)二硫鍵，且具有還原性 質(zhì)的化合物，如：二硫蘇糖醇（DTT)，N-乙酰半胱氨酸（NAC)，三（2-羧乙基）膦（TCEP)， 巰基乙醇等；2.作用于黏蛋白且具有消化能力的酶，如胰蛋白酶，糜蛋白酶等。胰蛋白 酶（CAS:9002-07-7，Trypsin/Parenzyme)作為蛋白酶的一種，最適溫度為37°C，最適pH為 7.8-8. 5,但pH值為2. 0-3.0時(shí)活性穩(wěn)定，pH值>5.0時(shí)易發(fā)生自溶從而導(dǎo)致失活，pH值 >9.0時(shí)會(huì)發(fā)生不可逆失活。
[0004] 研究表明，1.胰蛋白酶能作用于黏蛋白，通過(guò)分解黏蛋白來(lái)分離出包裹在黏蛋 白中的細(xì)菌，從而提高致病菌的檢出率及活性，為痰涂片和痰培養(yǎng)過(guò)程創(chuàng)造更良好條件； 2.胰蛋白酶保持穩(wěn)定的pH和工作pH有較大差異，保持穩(wěn)定的最佳pH值為2-3,pH值>5時(shí) 易自溶，而工作pH接近中性，約為7. 8-8. 5 ;3.胰蛋白酶的穩(wěn)定儲(chǔ)存的溫度與工作溫度有較 大差異，穩(wěn)定儲(chǔ)存溫度最適為_(kāi)20°C，在室溫條件下酶活性迅速降低；4.胰蛋白酶保持穩(wěn)定 的濃度與工作濃度有較大差異，在高胰蛋白酶濃度的條件下冷凍才能穩(wěn)定儲(chǔ)存，在低胰蛋 白酶濃度的條件下室溫儲(chǔ)存穩(wěn)定性差，24h后酶活性幾乎降為0 ;5.穩(wěn)定儲(chǔ)存時(shí)胰蛋白酶濃 度約為2. 5wt% (_20°C冷凍），而胰蛋白工作濃度通常為0? 25wt%或0? 125wt%左右。
[0005] 現(xiàn)有的胰蛋白酶消化液的使用主要有以下兩種形式：1.現(xiàn)配現(xiàn)用型，如英國(guó) Sputasol試劑，需要人工從高濃度稀釋到低濃度的步驟，且稀釋后2-8°C儲(chǔ)存活性只能保 持48小時(shí)。工作量大，效率低，耗時(shí)間，需要增加冷藏設(shè)備，同時(shí)試劑有效期短易造成浪費(fèi)； 2.部分胰蛋白酶商品化試劑需分開(kāi)低溫存儲(chǔ)（A液+B液：A液為工作pH緩沖液，B液為高 濃度低pH的胰蛋白酶）。使用時(shí)，先在痰標(biāo)本中加入A液，處理一段時(shí)間后加入B液，從而 達(dá)到胰蛋白酶的工作pH及工作濃度，對(duì)痰液進(jìn)行消化。此種方法必然會(huì)增加試劑的存儲(chǔ)成 本，同時(shí)也存在工作量大，效率低，耗時(shí)間的問(wèn)題，并且混合液的穩(wěn)定性差。
[0006] 采用上述第二種方式的胰蛋白酶商品化試劑甚至需要進(jìn)行復(fù)融操作（A液需 要-20°C冷凍），并且在室溫條件下無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間保持高活性，需要低溫保存，從而大大增加 操作時(shí)間及成本。
[0007] 以上胰蛋白酶痰消化液的使用方法均存在步驟過(guò)多、操作繁瑣等問(wèn)題，大大增加 醫(yī)生時(shí)間成本和存儲(chǔ)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能在工作pH、工作濃度條件下，并且室溫 穩(wěn)定存儲(chǔ)的胰蛋白酶消化液。
[0009] 另，本發(fā)明還提供一種上述胰蛋白酶消化液的制備方法。
[0010] 此外，本發(fā)明還提供一種含有上述胰蛋白酶消化液的即用型痰消化裝置。
[0011] 本發(fā)明解決上述問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
[0012] 一種胰蛋白酶消化液，其主要成分為胰蛋白酶與溶液穩(wěn)定劑，其中，所述溶液穩(wěn)定 劑選自以下物質(zhì)中的至少一種：糊精、海藻糖、牛血清白蛋白。
[0013]本發(fā)明通過(guò)選擇特定的溶液穩(wěn)定劑，從而實(shí)現(xiàn)了所述胰蛋白酶消化液能夠室溫穩(wěn) 定存儲(chǔ)，胰蛋白酶酶活性保持較高水平。作為消化液組成的一部分，胰蛋白酶的室溫穩(wěn)定期 通常僅為數(shù)小時(shí)，不超過(guò)24小時(shí)，因此，通常需要低溫儲(chǔ)存且在2-8°C低溫下穩(wěn)定存儲(chǔ)時(shí)間 僅為幾天至三周左右。而本申請(qǐng)通過(guò)在胰蛋白酶消化液中添加使胰蛋白酶穩(wěn)定的特定的 溶液穩(wěn)定劑，使得消化液在室溫下穩(wěn)定儲(chǔ)存至少7-10天，且酶活性保持初始酶活的80%以 上。
[0014] 其中，所述溶液穩(wěn)定劑的含量可以為0. 10-2.OOwt%，進(jìn)一步優(yōu)選為 0? 10-1.OOwt%。
[0015] 現(xiàn)有技術(shù)中胰蛋白酶只能在高濃度低溫條件下穩(wěn)定儲(chǔ)存，而在使用時(shí)將胰蛋白酶 與工作pH緩沖液相混合配制以達(dá)到胰蛋白酶的工作濃度，從而對(duì)痰液進(jìn)行消化，儲(chǔ)存及操 作繁瑣，上述加有特定溶液穩(wěn)定劑的胰蛋白酶消化液能夠在室溫下穩(wěn)定存儲(chǔ)，作為其優(yōu)選， 還可直接將所述胰蛋白酶配制至其工作濃度，即，在所述胰蛋白酶消化液中，將所述胰蛋白 酶的含量配制為〇. 10-1. 〇〇wt%，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 10-0. 60wt%。如此，既不造成胰蛋白酶 的浪費(fèi)，同時(shí)低濃度條件使得痰消化液對(duì)痰液標(biāo)本處理過(guò)程更加溫和。并且本申請(qǐng)發(fā)明人 還發(fā)現(xiàn)，在加有特定溶液穩(wěn)定劑的胰蛋白酶消化液中，若將胰蛋白酶的含量配制至其工作 濃度，還能進(jìn)一步提高痰消化液的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，尤其是室溫儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
[0016] 如現(xiàn)有技術(shù)中，通常將高濃度低pH胰蛋白酶與工作pH緩沖液相混合，一方面能夠 將所述胰蛋白酶配制至其工作濃度及工作pH，另一方面，加入的pH緩沖液還能夠?qū)ο?的細(xì)菌起到一定保護(hù)作用，避免細(xì)菌因外界環(huán)境的突然改變而死亡。
[0017]而本發(fā)明中作為進(jìn)一步的優(yōu)選，可直接將所述胰蛋白酶消化液配制至胰蛋白酶的 工作pH條件，一方面節(jié)約了存儲(chǔ)成本及時(shí)間成本，配制后的胰蛋白酶消化液可直接投入使 用，而不需再分開(kāi)存儲(chǔ)A液及B液，也避免了現(xiàn)場(chǎng)配制等繁瑣操作。另一方面也能對(duì)消化后 的細(xì)菌起到一定保護(hù)作用。而要將所述胰蛋白酶消化液配制至胰蛋白酶的工作PH，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可通過(guò)加入適宜的pH緩沖液并將該胰蛋白酶消化液調(diào)至其工作pH即可，S卩，將所 述胰蛋白酶消化液的PH值調(diào)節(jié)至4. 00-9. 00,進(jìn)一步優(yōu)選為6. 00-8. 00。
[0018] 而本發(fā)明中優(yōu)選生物緩沖劑及pH調(diào)節(jié)劑相配合使用將所述胰蛋白酶消化液的pH 值調(diào)至其工作pH，一方面能夠?qū)ο蟮募?xì)菌起到一定保護(hù)作用，另一方面還能夠?qū)λ?胰蛋白酶的活性具有一定的保護(hù)作用，從而進(jìn)一步提高該胰蛋白酶消化液的儲(chǔ)存穩(wěn)定性， 尤其是室溫儲(chǔ)存穩(wěn)定性，使胰蛋白酶消化液在室溫下穩(wěn)定儲(chǔ)存12個(gè)月之久，且保持胰蛋白 酶酶活性保持初始酶活的80%以上。
[0019]其中，所述生物緩沖劑的含量為0. 50-3. 00wt%，進(jìn)一步地優(yōu)選為1. 00-2. 00wt%。 所述生物緩沖劑可以選自以下物質(zhì)中的一種：N，N-二（2-羥乙基）-2_氨基乙磺酸（BES)、 N-三（羥甲基）甲基-2-氨基乙磺酸（TES)、三羥甲基甲胺基丙磺酸（TAPS)、2-(N-嗎啉） 乙磺酸（MES)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)或硼酸。所述生物緩沖劑一方面能夠保護(hù)胰 蛋白酶活性，另一方面還能夠使經(jīng)過(guò)痰消化液消化的細(xì)菌處在相對(duì)中性的環(huán)境中，不會(huì)造 成細(xì)菌周?chē)h(huán)境的劇烈改變，有利于細(xì)菌的存活，從而提高致病菌的檢出能力。
[0020] 其中，所述pH調(diào)節(jié)劑可以為氫氧化鈉（NaOH)、氫氧化鉀（K0H)等金屬氫氧化物、或 金屬氫氧化物的溶液、或三羥甲基氨基甲烷（Tris)等。在胰蛋白酶消化液中添加pH調(diào)節(jié) 劑配合生物緩沖劑使用，能將溶液pH值調(diào)至生物緩沖劑的緩沖范圍且接近中性，保證消化 后細(xì)菌不會(huì)因?yàn)榄h(huán)境的改變而死亡，提高細(xì)菌檢出率。同時(shí)，該pH條件使得胰蛋白酶直接 處于工作pH條件下，不需要額外的低pH儲(chǔ)存條件，從而簡(jiǎn)化了A液與B液分開(kāi)儲(chǔ)存再混合 的繁瑣步驟。
[0021] 作為本發(fā)明中的進(jìn)一步優(yōu)選，為使配制后的胰蛋白酶消化液的致病菌檢出率更 高，保護(hù)消化后的細(xì)菌避免其死亡，所述胰蛋白酶消化液還包括1. 00-8.OOwt%的離子強(qiáng)度 調(diào)節(jié)劑，進(jìn)一步地優(yōu)選為3. 00-6.O