一種獲取牛干擾素α的基因的引物、重組牛干擾素α的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因重組技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種獲取牛干擾素α的基因的引物、重組牛干擾素α的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著近年來(lái)全球畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)已由農(nóng)村家庭副業(yè)發(fā)展成了社會(huì)一大產(chǎn)業(yè)，無(wú)論是獸類的品種還是數(shù)量都位于世界前列。然而，養(yǎng)獸業(yè)還存在很多問(wèn)題，如水皰性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞病毒等傳染性疾病，每年都會(huì)在不同的季節(jié)暴發(fā)，這些動(dòng)物一旦感染發(fā)病，則初發(fā)病急、臨床癥狀嚴(yán)重、極易傳播擴(kuò)散以及病死率和死亡率均較高的特點(diǎn)，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]目前獸類傳染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和藥物治療，由于疫苗免疫的血清型單一，而病毒的血清型復(fù)雜，毒株變異快，常導(dǎo)致疫苗免疫失敗。一些病毒病目前尚無(wú)疫苗可用，有些病毒也可能直接危害到人類的健康。
[0004]常用的藥物治療主要采用抗生素進(jìn)行治療，但是近年來(lái)由于抗生素的廣泛和大量使用，導(dǎo)致耐藥性菌株大量產(chǎn)生，并通過(guò)食物鏈傳染給人，給人類健康帶來(lái)更大的威脅?，F(xiàn)在一些國(guó)家己明令禁止一些抗生素和抗菌劑在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。因此，使用干擾素來(lái)積極治療和預(yù)防家禽、家畜的病毒性疾病將是人類最為關(guān)注的問(wèn)題。
[0005]干擾素(Interferon，IFN)是一類由病毒及脂多糖等物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，1957年由Issacs和Lindeman首先發(fā)現(xiàn)。它是一類多功能的細(xì)胞因子，與細(xì)胞受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種特異性蛋白質(zhì)和酶類，主要通過(guò)抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和降解病毒RNA來(lái)抑制病毒的生長(zhǎng)繁殖及發(fā)揮抗腫瘤等的活性。按照IFN的產(chǎn)生細(xì)胞、生化特征及在機(jī)體免疫方面所發(fā)揮的作用不同，分為α、β、γ三種型。現(xiàn)已知，干擾素α在體內(nèi)可有選擇性地作用于病毒感染細(xì)胞，通過(guò)抑制受染細(xì)胞內(nèi)的病毒蛋白質(zhì)的生物合成，發(fā)揮廣譜和高效抗病毒作用，但對(duì)正常宿主細(xì)胞無(wú)作用。
[0006]目前重組牛干擾素α鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種獲取牛干擾素α的基因的引物和一種重組牛干擾素α的制備方法，制備的重組牛干擾素α可用于治療牛水皰性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞病毒等引起的疾病。
[0008]一種獲取牛干擾素α的基因的引物，所述引物的序列為:
[0009]上游:ATAGGA TCC TGC CAC CTGGCCT CAC
[0010]下游:ATAAAG CTT TCA GTC CTT TCT CCT G ；
[0011]引物分別帶有BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)。
[0012]本發(fā)明提供的一種重組牛干擾素α的制備方法，包括以下步驟:
[0013]a、牛干擾素α基因的獲取；
[0014]b、構(gòu)建克隆載體；
[0015]C、構(gòu)建表達(dá)載體；
[0016]d、重組蛋白的表達(dá)；
[0017]e、重組牛干擾素α粗制品的制備；
[0018]f、重組牛干擾素α粗制品純化。
[0019]步驟a、牛干擾素α基因的獲取，包括以下步驟:
[0020]采用TAKARA公司RNA提取試劑盒從牛肝臟組織中提取RNA，并利用引物進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)；
[0021]引物序列:上游:ATAGGA TCC TGC CAC CTGGCCT CAC
[0022]下游:ATAAAG CTT TCA GTC CTT TCT CCT G
[0023]引物分別帶有BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)；
[0024]牛干擾素α目的基因如SEQ ID NO I所示；
[0025]提取RNA反應(yīng)條件:在25 μ L的總反應(yīng)體系中，基因組DNA 1.5 μ 1，上下游引物各0.5 μ 1，PCR Mix 為 12.5 μ 1，加無(wú)菌水至 25 μ I ；
[0026]RT-PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30S，55°C退火 40S，72°C延伸 40s，循環(huán)35次，最后72°C延伸20min，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)膠回收試劑盒回收。
[0027]步驟b、構(gòu)建克隆載體，包括以下步驟:
[0028]PCR擴(kuò)增牛干擾素α目的基因后，將目的基因克隆于pMD18_T simple vector至并轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌涂LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，取白色樣的克隆菌進(jìn)行目的基因PCR驗(yàn)證，并進(jìn)行雙酶切鑒定。
[0029]步驟c.構(gòu)建表達(dá)載體，包括以下步驟:
[0030]選擇目的基因經(jīng)測(cè)序后與Genebank —致的克隆載體進(jìn)行雙酶切后與分別與表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至BL21大腸桿菌，分別涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)過(guò)夜，取LB平板上生長(zhǎng)的菌落經(jīng)PCR鑒定目的基因，陽(yáng)性克隆菌質(zhì)粒行BamHI和HindIII雙酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性者表示表達(dá)載體構(gòu)建成功。
[0031]步驟d、重組蛋白的表達(dá)，包括以下步驟:
[0032]分別挑取與pET_32a表達(dá)載體連接的重組牛干擾素α工程菌于含氨芐青霉素100 μ g/ml的LB培養(yǎng)基中少量擴(kuò)增，后在LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100 μ g/ml)中放大培養(yǎng)2?3h后，測(cè)OD值在0.6?0.8時(shí)，加入IPTG，32°C誘導(dǎo)表達(dá)(終濃度100 μ g/ml) 5h，收集細(xì)菌。
[0033]步驟e、重組牛干擾素α粗制品的制備，包括以下步驟:
[0034]收集細(xì)菌，-20°C與室溫反復(fù)凍融沉淀3次，4°C超聲裂解細(xì)菌沉淀，功率:400W，工作3S，間隔3S，超聲6min，重復(fù)3?4次，離心12000r/min離心15min獲得上清、沉淀，得到粗制蛋白。
[0035]步驟f、重組牛干擾素α粗制品純化，包括以下步驟:
[0036]f.1AKTA? explorer蛋白純化儀親和層析精純蛋白:
[0037]f.1.1親和層析:
[0038]將粗制蛋白過(guò)濾處理后過(guò)GST親和層析柱，用Elut1n buffer (50mMTris_Cl40mM還原性谷胱甘肽pH 8.0)梯度洗脫，收集牛干擾素α峰；
[0039]f.1.2脫鹽、緩沖液置換:
[0040]將第一步純化的牛干擾素α過(guò)脫鹽柱，用緩沖液(50mMTris-Cl pH6.5)置換，準(zhǔn)備下一步離子交換層析；
[0041]f.1.3離子交換層析:
[0042]分別用Loading buffer(50mMTris_Cl pH6.5)平衡好柱體，上樣后用 Elut1nbuffer (50mMTris-Cl IM NaCl pH6.5)梯度洗脫，收集牛干擾素α峰；
[0043]f.1.4分子篩層析:
[0044]離子交換層析收集到的牛干擾素α過(guò)分子篩層析柱，Elut1nbuffer (50mMNa2HP040.15MNaCl ρΗ7.0)收集牛干擾素 α 峰；
[0045]測(cè)定牛干擾素α效價(jià)及比活性，比活性彡1.0X106IU/mg蛋白為合格；無(wú)菌分裝，-70°C保存。
[0046]本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，從牛肝臟組織中提取RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，并將擴(kuò)增出的牛干擾素α基因克隆于T載體后再連接至原核表達(dá)載體pET_32a中，以大腸埃希菌BL21(DE3)作為原核表達(dá)的宿主菌，構(gòu)建成BL21/pET-32a-BovIFNa工程菌，并在通過(guò)PCR、雙酶切鑒定后用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)牛干擾素a，經(jīng)純化后除菌、分裝和凍干，制成凍干粉針劑。
[0047]本發(fā)明制備的重組牛干擾素a的凍干粉針劑，加2ml無(wú)菌雙蒸水后，能迅速溶解為均勻懸濁液，規(guī)格為:牛干擾素a含量彡2萬(wàn)IU/瓶，2?8°C可長(zhǎng)期保存，室溫(<25°C)可保存兩年。使用時(shí)輕輕搖勻后即可進(jìn)行接種，小牛5000IU/頭/天，成年牛20000IU/頭/天，每日一次，一個(gè)療程3?5次。在治療已發(fā)病牛的同時(shí)，應(yīng)及時(shí)隔離未發(fā)病牛，并給予等量相應(yīng)藥物預(yù)防。
[0048]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，所制的重組牛干擾素a是一類能誘導(dǎo)牛細(xì)胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的細(xì)胞因子，能夠治療牛水皰性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞病毒等引起的疾病。
【附圖說(shuō)明】
[0049]圖1為牛干擾素a基因RT-PCR擴(kuò)增的結(jié)果；
[0050]在圖1中，M:DNA Marker DL2000，I?6:牛干擾素α基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在498bp左右出現(xiàn)單一條帶，7:PCR陰性對(duì)照；
[0051]圖2為重組質(zhì)粒pMD18-T/BovIFN_ a PCR鑒定結(jié)果；
[0052]在圖2 中，M:DNA Marker DL2000，1:以重組質(zhì)粒 pMD18_T/ChIFN α 為模板 PCR 產(chǎn)物在498bp處出現(xiàn)單一條帶；
[0053]圖3為重組質(zhì)粒pET32/BovIFN- α雙酶切鑒定結(jié)果；
[0054]在圖3 中，M:DNA Marker DL2000，I ?2:重組質(zhì)粒 pET-32a_BovIFNa BamHI 和Hind III酶切鑒定結(jié)果；
[0055]圖4為重組質(zhì)粒pET32/BovIFN_ α的PCR結(jié)果；
[0056]在圖4 中，M:DNA Marker DL2000，I ?5:以重組質(zhì)粒 pET-32a_BovIFN α 模板 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，6:PCR陰性對(duì)照；
[0057]圖5為0.5mmol/L IPTG 32°C誘導(dǎo)的重組牛干擾素α蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果;
[0058]在圖5中，M為:蛋白Marker，1:1PTG 32°C誘導(dǎo)后空菌菌體，2?4:不同重組牛干擾素α工程菌誘導(dǎo)5h后的結(jié)果，其中3泳道的工程菌目的蛋白表達(dá)量最高；
[0059]圖6重組牛干擾素α蛋白可溶性表達(dá)鑒定結(jié)果；
[0060]M為:蛋白Marker，1:重組牛干擾素α工程菌誘導(dǎo)5h后的菌體破碎后上清，2:重組牛干擾素α工程菌誘導(dǎo)5h后的菌體破碎后沉淀，3:重組牛干擾素α工程菌誘導(dǎo)5h后的菌體?？梢?jiàn)重組菌誘導(dǎo)5h后的菌體破碎后上清在35KD處優(yōu)勢(shì)表達(dá)條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0061]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的說(shuō)明。
[0062]實(shí)施例1:
[0063]一種重組牛干擾素α的制備方法，包括以下步驟:
[0064]a.牛干擾素α基因的獲取，包括以下步驟:
[0065]采用TAKARA公司RNA提取試劑盒從牛肝臟組織中提取RNA，并利用引物進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)；
[0066]引物序列:上游:ATAGGA TCC TGC CAC CTGGCCT CAC
[0067]下游:ATAAAG CTT TCA GTC CTT TCT CCT G
[0068]引物分別帶有BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)；
[0069]牛干擾素α目的基因?yàn)?
[0070]tgccacctgc ctcacaccca cagcctggcc aacaggaggg tcctgatgct cctgcaacaa 60
[0071]ctgagaaggg tctccccttc ctcctgcctg caggacagaa atgacttcga attcctccag 120
[0072]gaggctctgg gtggcagcca gttgcagaag gctcaagcca tctctgtgct ccacgaggtg 180
[0073]acccagcaca ccttccagct cttcagcaca gagggctcgc ccgccacgtg g