一種y型探針組及其應(yīng)用、方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)領(lǐng)域，特別是指一種Y型探針組，本發(fā)明還涉及一種Y型探針組在核酸檢測(cè)的應(yīng)用和方法，以及核酸檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)出核酸檢測(cè)主要有PCR和基因芯片等方法，這些方面一般都存在操作過程極為復(fù)雜，并且由于過程的復(fù)雜性等，造成檢測(cè)的可重復(fù)性差，另外，還存在檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)的問題，因此，一直為實(shí)驗(yàn)室研究人員所詬病，急需對(duì)此進(jìn)行結(jié)果，以提高檢測(cè)的效率，降低檢測(cè)的成本，提高檢測(cè)的穩(wěn)定性，便捷性等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的之一在于提供了一種Y型探針組，結(jié)構(gòu)合理，適于進(jìn)行核酸的快速檢測(cè)。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:
一種Y型探針組，包括探針A和探針B，所述探針A的中部與探針B的3’末端2-4個(gè)堿基的互補(bǔ)，優(yōu)選3個(gè)，另外，根據(jù)探針的功能，所述探針A和所述探針B均為單鏈。
[0005]進(jìn)一步，所述探針A與所述探針B能夠同時(shí)與待檢測(cè)核酸序列結(jié)合。
[0006]進(jìn)一步，所述探針A與所述探針B同時(shí)與待檢測(cè)核酸序列結(jié)合后，三者整體呈Y型。
[0007]進(jìn)一步，所述探針A與所述探針B均與待檢測(cè)核酸序列有不少于10個(gè)的堿基互補(bǔ)配對(duì)。
[0008]進(jìn)一步，所述探針B未與所述探針A以及待檢測(cè)核酸序列結(jié)合的區(qū)域中間，有一段酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)序列。
[0009]從而，在沒有待檢核酸檢測(cè)序列(Targer)存在的情況下，所述探針A和所述探針B在37°C不能結(jié)合，而當(dāng)有Target存在時(shí)，所述探針A和所述探針B各自都有10個(gè)以上堿基和Target互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合,在Target介導(dǎo)下,B的3’末端3個(gè)堿基和A互補(bǔ)配對(duì),在聚合酶存在的情況下引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)，因?yàn)樗鎏结楢上有一段酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)序列，所以擴(kuò)增的片段在中間有酶切位點(diǎn)，可被切刻酶識(shí)別，從而在有切割酶存在的情況下，會(huì)切斷雙鏈中的一條鏈，而在切口處聚合酶繼續(xù)擴(kuò)增，延伸，繼續(xù)被切，循環(huán)往復(fù)，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，可以得到大量的切割下來(lái)的單鏈片段。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種Y型探針組的應(yīng)用。
[0011]所述Y型探針組在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的另一目的在于提供了一種基于Y型探針組的核酸檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)迅速，而且結(jié)果可靠穩(wěn)定。
[0013]一種基于Y型探針組的核酸檢測(cè)方法，利用所述Y型探針組、擴(kuò)增以及膠體金檢測(cè)進(jìn)行。
[0014]所述于Y型探針組的核酸檢測(cè)方法，通過將所述Y型探針組與待檢測(cè)序列結(jié)合，使所述探針B在聚合酶的作用下，沿探針A進(jìn)行擴(kuò)增形成雙鏈，擴(kuò)增的片段在中間有酶切位點(diǎn)，可被切刻酶識(shí)別，從而切斷雙鏈中的一條鏈，在切口處聚合酶繼續(xù)擴(kuò)增，延伸，繼續(xù)被切，循環(huán)往復(fù)，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，然后通過對(duì)被切割下來(lái)的片段進(jìn)行膠體金檢測(cè)，并觀察結(jié)果。
[0015]所述于Y型探針組的核酸檢測(cè)方法，包括以下步驟:
制備反應(yīng)液；
制備膠體金；
制備膠體金-核酸偶聯(lián)物；
檢測(cè)。
[0016]其中，制備反應(yīng)液包括:將探針A、探針B、待檢測(cè)核酸序列加入反應(yīng)緩沖液中，混勻，37°C條件下擴(kuò)增反應(yīng)；
其中，制備膠體金包括:向容器中加入100 ml 0.01%的HAuCl4溶液，攪拌加熱至沸騰后，加入4 ml 1%枸櫞酸鈉，溶液變?yōu)榫萍t色后，繼續(xù)煮沸10分鐘，停止加熱繼續(xù)攪拌15分鐘，得到膠體金溶液，膠體金溶液4°C避光保存。
[0017]其中，制備膠體金-核酸偶聯(lián)物包括:
(I)取10倍濃縮的金納米顆粒900 L，加入100 L超純水溶解的巰基修飾的DNA，充分混勻。
[0018](2) 4 °C反應(yīng) 24 小時(shí)。
[0019](3)用10%的BSA進(jìn)行封閉，逐滴加入10%的BSA約100 L，加邊震蕩，使BSA的終濃度為1%，充分混勻。
[0020](4) 4 °C封閉 4 小時(shí)。
[0021](5)加入1.5 M的NaCl溶液和1%的SDS溶液，緩慢滴加，邊加邊震蕩，使NaCl的終濃度為150 mmol/L, SDS的終濃度為0.01%。充分混勻。
[0022](6) 4 °C老化 24 小時(shí)。
[0023](7) 4 °C離心，12，000 rpm, 20分鐘，棄上清。沉淀用金重懸液重懸,重復(fù)離心2-3次，棄上清，留沉淀。
[0024](8)用I mL金重懸液重懸核酸-金標(biāo)記物沉淀，得到反應(yīng)液C，4 1:保存?zhèn)溆谩?br>[0025]其中，檢測(cè)包括:將上述反應(yīng)液C加入2微升AuNP-核酸偶聯(lián)物，轉(zhuǎn)移到試紙條上，加入40微升的上樣緩沖液，進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間為30-90min，觀察。
[0026]作為本發(fā)明的另一個(gè)目的，還提供了一種基于Y型探針組的核酸檢測(cè)試劑盒，操作方便，適合推廣。
[0027]一種基于所述Y型探針組的核酸檢測(cè)試劑盒，包括:具有粘性的底板；硝酸纖維素膜粘貼在所述底板的中部；所述硝酸纖維素膜上劃有跟Click Azide片段互補(bǔ)的核酸，作為檢測(cè)線，和Click CHCH核酸，作為質(zhì)控線；金標(biāo)墊粘貼在所述硝酸纖維素膜的一側(cè)的底板上，所述金標(biāo)墊與所述硝酸纖維素膜之間有2-3_的重疊；吸水紙粘貼在所述硝酸纖維素膜的另一側(cè)的底板上，所述吸水紙與所述硝酸纖維素膜之間有2-3_的重疊；樣品墊，粘貼在所述底板上，所述樣品墊與所述金標(biāo)墊之間有2-3mm的重疊。
[0028]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的所述Y型探針組，結(jié)構(gòu)特殊，能實(shí)現(xiàn)在沒有Target存在時(shí)不結(jié)合,有Target實(shí)現(xiàn)結(jié)合,并在聚合酶的作用下實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增等，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合理，方便進(jìn)行核酸檢測(cè)，本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，特異性好，對(duì)樣本的要求低，可以用于實(shí)際樣品的定量檢測(cè)；靈敏度高，對(duì)核酸的檢測(cè)限為20 PM，不需要使用復(fù)雜的儀器，使用普通的讀卡儀就能讀數(shù)，本發(fā)明的試劑盒操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)迅速。
【附圖說明】
[0029]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0030]圖1為本發(fā)明所述的基于Y型探針的核酸檢測(cè)方法的原理圖；
圖2為本發(fā)明所述的基于Y型探針的核酸檢測(cè)方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；
圖3為本發(fā)明所述的基于Y型探針的核酸檢測(cè)方法的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例