具有殺菌活性的煙粉虱肽聚糖識別蛋白的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種煙粉虱肽聚糖 識別蛋白（BtPGRP)基因及其所編碼蛋白的應(yīng)用，尤其涉及一種煙粉虱肽聚糖識別蛋白 (BtPGRP)的體外重組表達(dá)技術(shù)、活性重組蛋白的分離純化以及對微生物的識別和殺菌抑菌 作用研究。
【背景技術(shù)】
[0002] 天然免疫反應(yīng)是機(jī)體防御感染性疾病的一道重要防線，這一防御系統(tǒng)對于所有 多細(xì)胞生物生存和物種延續(xù)都是非常重要的。不同于哺乳動物，昆蟲無免疫球蛋白，缺乏 獲得性免疫，因此昆蟲生存一大挑戰(zhàn)就是識別外來病原物。在長期進(jìn)化過程中發(fā)展出了 一套獨(dú)特的病原物識別模式，可以識別病原物外壁脂多糖（LPS)、脂磷壁酸質(zhì)類、脂蛋白、 肽聚糖（PGN)、0-1，3-葡聚糖并對其作出防御反應(yīng)。這種病原微生物表面某些共有的高 度保守的分子結(jié)構(gòu)稱為病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associatedmolecularpattern, PAMP)。免疫識別在進(jìn)化過程中發(fā)展出多種能夠識別一種或多種PAMP分子的模式識別受 體（patternrecognitionreceptor,PRP)，如清道夫受體（SCRs)、C-型凝集素（CTLs)、 革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白GNBPs(Gram-negativebindingproteins)和肽聚糖識別蛋白 PGRPs(peptidoglycanrecognitionproteins)等。膚聚糖識別蛋白PGRPs是一類重要 的模式識別受體（PRR)，在識別病原體入侵和激活免疫調(diào)控途徑中發(fā)揮著重要作用。肽聚 糖識別蛋白PGRP是在家蠶Bombyxmori中首次發(fā)現(xiàn)的，該蛋白能夠結(jié)合肽聚糖，激活多酚 氧化酶級聯(lián)反應(yīng)。PGRP存在1個與17溶菌酶同源的結(jié)構(gòu)域，并具有Zn依賴的N-乙酰胞 壁丙氨酸酰胺酶活性。目前在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster基因組中共發(fā)現(xiàn)了 13個PGRP基因編碼17個PGRP蛋白、岡比亞按蚊Anophelesgambiae基因組中發(fā)現(xiàn)7個 PGRP基因，同源比對發(fā)現(xiàn)這些基因與哺乳動物PGRPs基因高度保守。目前研究發(fā)現(xiàn)PGRP在 昆蟲先天免疫中可分為以下幾類：a)識別病原體后誘發(fā)酚氧化酶原級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生黑色素 來包裹微生物；b)識別革蘭氏陽性菌，激活Toll信號通路（PGRP-SA) ;c)識別革蘭氏陰性 菌，激活I(lǐng)md信號通路，誘導(dǎo)自我吞噬；d)酰胺酶活性，使PGN失活。此外，哺乳動物（人和 大鼠）中PGRP還具有抗細(xì)菌活性。最近研究發(fā)現(xiàn)昆蟲中果蠅的PGRP-SB1、熊PGRP-S對芽 孢桿菌有抗菌作用。PGRP蛋白的殺菌機(jī)制有兩種：一種是出于PGRP與肽聚糖不可逆的結(jié) 合，從而干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成；另一種是一些PGRP具有酰胺酶活性?？梢越到怆木厶?，從 而破壞細(xì)胞壁使菌體破裂，這種殺菌作用類似于青霉素。
[0003] 肽聚糖識別蛋白的結(jié)構(gòu)和功能在昆蟲和哺乳動物中已得到一定程度的研究， 但是，目前國內(nèi)外尚沒有煙粉虱肽聚糖識別蛋白BtPGRP的研究報道。煙粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)已成為一種世界性的入侵性災(zāi)害性昆蟲，在世界各地暴發(fā)成災(zāi)，造成慘 重的損失。該蟲不僅大量取食植物汁液，導(dǎo)致植物枯萎，而且傳播多種植物病毒，是重要的 病毒傳播媒介，常導(dǎo)致植物病毒病大流行，使作物嚴(yán)重減產(chǎn)或絕收。PGRP在傳毒媒介昆蟲 煙粉虱中的研究，有利于更好的揭示其在免疫反應(yīng)以及傳播植物病毒中的作用及其工作機(jī) 制，同時也為開發(fā)廣譜抗菌藥物和篩選免疫增強(qiáng)劑提供依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對目前煙粉虱免疫反應(yīng)研究狀況及其不足，提供 一種具有殺菌活性的煙粉虱肽聚糖識別蛋白（BtPGRP)蛋白的制備及應(yīng)用。
[0005] 為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：
[0006] 本發(fā)明提供了一種煙粉虱肽聚糖識別蛋白編碼基因，該基因的核苷酸序列如 SEQIDNO. 1 所示。
[0007] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了由煙粉虱肽聚糖識別蛋白編碼基因編碼的蛋白，該蛋白的氨 基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了前述煙粉虱肽聚糖識別蛋白編碼基因在制備具有抗菌活性 的重組蛋白中的方法，是通過基因重組技術(shù)使所述基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，獲得具有 抗菌活性的重組蛋白。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了前述蛋白在制備抗菌類藥物、食品保鮮劑或飼料添加劑中的 應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0011] 本發(fā)明所提供的煙粉虱肽聚糖識別蛋白BtPGRP基因及其編碼的核苷酸序列，使 其能夠應(yīng)用在大腸桿菌中表達(dá)新的蛋白、編碼序列。所述抗菌活性的重組蛋白純化后進(jìn)行 抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：重組的煙粉虱肽聚糖識別蛋白基因BtPGRP原核表達(dá)的重組蛋白具 有結(jié)合革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的能力，同時能夠殺滅革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性 菌。進(jìn)一步的，利用本發(fā)明的方法通過現(xiàn)有基因工程方法生產(chǎn)，在開發(fā)廣譜抗菌類藥物和新 型免疫增強(qiáng)劑、飼料添加劑等方面具有潛在的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0012] 圖1為IPTG誘導(dǎo)的pET28a-BtPGRP-BL21和純化的重組煙粉虱肽聚糖識別蛋白 BtPGRP蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖。1 :未誘導(dǎo)pET28a-BtPGRP-BL21 菌株；Lane2:ImM IPTG誘導(dǎo)的pET28a-BtPGRP-BL21菌株；3 :純化重組蛋白；M:蛋白Marker。
[0013] 圖2為煙粉虱肽聚糖識別蛋白BtPGRP基因重組蛋白對大腸桿菌的識別作用圖。
[0014] 圖3為煙粉虱肽聚糖識別蛋白BtPGRP基因重組蛋白對金黃色葡萄球菌的識別作 用圖。
[0015] 圖4為煙粉虱肽聚糖識別蛋白BtPGRP基因重組蛋白對大腸桿菌E.coli的生長抑 制作用圖。
[0016] 圖5為煙粉虱肽聚糖識別蛋白BtPGRP基因重組蛋白對金黃色葡萄球菌S.aureus 的生長抑制作用圖。 具體實(shí)施方案
[0017] 本發(fā)明中，所述煙粉虱肽聚糖識別蛋白基因cDNA的克隆方法是以煙粉虱總RNA反 轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，構(gòu)建cDNA文庫，根據(jù)煙粉虱轉(zhuǎn)錄組篩選得到BtPGRP部分cDNA序 列，然后經(jīng)RACE方法擴(kuò)增得到末端序列，最后經(jīng)序列拼接獲得煙粉虱肽聚糖識別蛋白基因 cDNA全長序列。
[0018] 本發(fā)明用于表達(dá)煙粉虱肽聚糖識別蛋白重組蛋白的成熟肽基因序列是以煙粉虱 肽聚糖識別蛋白全長基因雙鏈DNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增而得到，它來源于煙粉虱肽聚糖 識別蛋白全長基因區(qū)域所對應(yīng)的基因片段。
[0019] 本發(fā)明上述含有煙粉虱肽聚糖識別蛋白基因的大腸桿菌基因表達(dá)載體優(yōu)先由本 發(fā)明合成的煙粉虱肽聚糖識別蛋白基因與大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a構(gòu)建的重組表達(dá)載 體,命名為pET28a-BtPGRP。
[0020] 本發(fā)明能表達(dá)煙粉虱肽聚糖識別蛋白基因的大腸桿菌重組菌株優(yōu)先由含有煙粉 虱肽聚糖識別蛋白的表達(dá)載體pET28a-BtPGRP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)而得到的菌株，命 名為pET28a-BtPGRP-BL21。
[0021] 上述煙粉虱肽聚糖識別蛋白的重組蛋白具體制備方法是通過如下技術(shù)方案來實(shí) 現(xiàn)：選取大腸桿菌重組菌株pET28a-BtPGRP-BL21接種在10ml含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng) 基，37°C培養(yǎng)過夜，取50yl菌液加入到裝有50mlKana+LB液體培養(yǎng)基的150ml無菌三角瓶 中，37°C，150rpm的搖箱中培養(yǎng)6?8h至對數(shù)期，加入lOOmMIPTG至終濃度為lmM，27°C， 250rpm振蕩培養(yǎng)。當(dāng)重組菌生長進(jìn)入平臺期后收集菌體，經(jīng)分離純化得到重組煙粉虱肽聚 糖識別蛋白。
[0022] 本發(fā)明所述煙粉虱肽聚糖識別蛋白BtPGRP在制備具有活性的重組蛋白中應(yīng) 用。其中，所述應(yīng)用的方法是通過基因重組