適用于植物表達(dá)體系的表達(dá)貝伐單抗的基因、重組載體及產(chǎn)貝伐單抗植物的構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及適用于植物表達(dá)體系的表達(dá)貝伐單抗的 基因、重組載體及產(chǎn)貝伐單抗植物的構(gòu)建方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，80年代初，科學(xué)家們開始利用基因工程技術(shù)來研制抗體， 并逐漸形成了一門新型的跨學(xué)科技術(shù)--抗體生物技術(shù)（Antibodybiotechnology)。它是 以DNA重組技術(shù)為手段，將動物淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體基因人為地改造后轉(zhuǎn)入真核或原核 細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生具有免疫活性的抗體或其功能片斷。
[0003] 目前，基因工程抗體的表達(dá)系統(tǒng)主要有哺乳動物細(xì)胞、大腸桿菌、酵母、昆蟲以及 植物，不同的表達(dá)系統(tǒng)各有利弊。1)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系：鼠骨髓瘤細(xì)胞是最理想的表 達(dá)宿主，此外還有一些B淋巴細(xì)胞來源的細(xì)胞系，這些細(xì)胞具有一整套完整的合成、組裝、 分泌免疫球蛋白的細(xì)胞裝置，能夠產(chǎn)生完整的抗體分子。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)點是能夠 將抗體多肽鏈正確裝配、折疊并糖基化成有活性的完整分子，可以表達(dá)足夠量的抗體，但生 產(chǎn)成本高。2)大腸桿菌體系：大腸桿菌已被廣泛地用于表達(dá)抗體功能片斷，如Fab、Fv和 SCFv，但目前它還不能表達(dá)完整的抗體分子。利用大腸桿菌表達(dá)小分子抗體，具有規(guī)模大、 速度快和成本低的優(yōu)點，但原核表達(dá)中的一個重要問題是如何有效地控制轉(zhuǎn)錄的起始，進(jìn) 行預(yù)想的表達(dá)。3)酵母表達(dá)體系：酵母能夠有效地表達(dá)、組裝和分泌具有免疫活性的抗體 或其功能片斷，但由于酵母對多肽的糖基化作用與哺乳動物細(xì)胞的修飾情況不同，從而影 響了抗體的ACDC(依賴抗體的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性）效力，目前認(rèn)為酵母并非是好的基因 工程抗體表達(dá)體系。4)植物表達(dá)體系：1989年美國醫(yī)學(xué)生物學(xué)家Hiatt首次報道了抗體在 植物中的表達(dá)。他的研宄結(jié)果是人類利用異質(zhì)細(xì)胞表達(dá)抗體的成功范例，打破了動植物種 屬之間的界限，引起了生物界的極大興趣和高度重視。研宄表明，植物表達(dá)抗體的一大優(yōu)勢 是能將全長重鏈和輕鏈組裝成帶有Fc區(qū)域的全抗體（而大腸桿菌能組裝的最大抗體片段 為單價Fab片段），這些抗體能功能性的識別抗原并結(jié)合抗原。
[0004] 研宄表明，在植物中表達(dá)出具有功能性識別抗原及結(jié)合特性的全抗體或部分抗體 片段是抗體基因工程研宄的一個新領(lǐng)域，它有如下優(yōu)點：（1)高表達(dá)量。在植物中表達(dá)抗 體，重組抗體的產(chǎn)率可達(dá)植物總蛋白的4%，這是一般真核表達(dá)系統(tǒng)所不能達(dá)到的；（2)低 成本。在植物中表達(dá)重組抗體，可用大規(guī)模大田種植，條件相對簡單，價格低廉；（3)外源抗 體基因片段可以整合進(jìn)染色體中穩(wěn)定遺傳，同時對植物的生長沒有影響；(4)轉(zhuǎn)基因植物 株可以很簡單地通過種子的形式長期保存；（5)植物細(xì)胞同哺乳動物細(xì)胞一樣可以對表達(dá) 的重組抗體蛋白進(jìn)行正確的組裝和后期加工，其表達(dá)產(chǎn)物還能保持良好的生物學(xué)特性；同 時由于植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗體是以二聚體形式存在，因此表達(dá)產(chǎn)物的親和力高，有助于 全面發(fā)揮抗體的功能。
[0005] 貝伐單抗，商品名為阿瓦斯?。ˋvastin)，是重組的人源化單克隆抗體，為羅氏公 司研發(fā)的癌癥治療暢銷藥物，由中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，分子量大約為149,000 道爾頓。貝伐單抗于2004年2月26日獲得FDA的批準(zhǔn)，是美國第一個獲得批準(zhǔn)上市的抑制 腫瘤血管生成的藥物，其2009年的銷售額達(dá)59億美元。在批準(zhǔn)用于治療乳腺癌之前，這種 藥物還被美國藥管局批準(zhǔn)用于治療肺癌、結(jié)腸癌和直腸癌，并已在歐洲獲準(zhǔn)用于治療乳腺 癌。貝伐單抗的作用機(jī)理為：通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowth Factor、VEGF)的作用阻斷對腫瘤的血液供應(yīng)，抑制腫瘤在體內(nèi)擴(kuò)散，增強(qiáng)化療效果。VEGF 為腫瘤血管生成的關(guān)鍵調(diào)控者，并且是唯一一種表達(dá)于整個腫瘤生命周期的血管生成因 子。VEGF的持續(xù)表達(dá)，以及VEGF和內(nèi)皮細(xì)胞的遺傳學(xué)穩(wěn)定性（基于臨床前研宄的觀察結(jié) 果），可使"直接并且持續(xù)靶向于VEGF"成為一種重要的抗腫瘤策略，因此，作為血管內(nèi)皮生 長因子的抑制劑，貝伐單抗作用效果好、應(yīng)用范圍廣。但是，目前貝伐單抗制作成本高，價格 昂貴，嚴(yán)重限制了其推廣和應(yīng)用，所以還需要研發(fā)新的貝伐單抗制備方法。作為一種優(yōu)良的 基因工程表達(dá)體系，植物表達(dá)體系無疑是優(yōu)選的貝伐單抗表達(dá)體系。目前，還沒有關(guān)于產(chǎn)貝 伐單抗的植物表達(dá)體系相關(guān)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種適用于植物表達(dá)體系的表達(dá)貝伐單抗 的基因、重組載體及產(chǎn)貝伐單抗植物的構(gòu)建方法及應(yīng)用。采用本發(fā)明提供的表達(dá)貝伐單抗 的基因成功構(gòu)建了產(chǎn)貝伐單抗的植物表達(dá)體系，所得植物能夠表達(dá)貝伐單抗，為貝伐單抗 的制備提供了新方法。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種適用于植物表達(dá)體系的表達(dá)貝伐單抗的基因，其包括表達(dá)貝伐 單抗重鏈的基因和表達(dá)貝伐單抗輕鏈的基因；
[0009] 該表達(dá)貝伐單抗重鏈的基因具有：
[0010] (I)如SEQIDN0:1所示的核苷酸序列；
[0011] 或（II)與所述如SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列具有彡70%同源性的序列；
[0012] 或（III)如SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷 酸獲得的核苷酸序列；
[0013] 該表達(dá)貝伐單抗輕鏈的基因具有：
[0014] ⑴如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；
[0015] 或（ii)與如SEQIDNO: 2所示的核苷酸序列具有彡70%同源性的序列；
[0016] 或（iii)如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷 酸獲得的核苷酸序列。
[0017] 在本發(fā)明中，貝伐單抗的重鏈具有如SEQIDN0:3所示的氨基酸序列。貝伐單抗 的輕鏈具有如SEQIDN0:4所示的氨基酸序列。
[0018] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的表達(dá)貝伐單抗的基因中的表達(dá)貝伐單抗 重鏈的基因具有如SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列，標(biāo)記為BHC。
[0019] 在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的表達(dá)貝伐單抗的基因中的表達(dá)貝伐 單抗輕鏈的基因具有如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列，標(biāo)記為BLC。
[0020] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的表達(dá)貝伐單抗的基因所適用的植物表達(dá)體系，具體為水稻。 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的表達(dá)貝伐單抗的基因所適用的水稻具體為日本晴 水稻。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種重組載體，其整合有本發(fā)明提供的表達(dá)貝伐單抗重鏈的基因 和/或所述表達(dá)貝伐單抗輕鏈的基因。
[0022] 用植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)完全抗體可采用不同的策略：一種是把重鏈和輕鏈基因分別 轉(zhuǎn)化植物，再通過有性雜交獲得共表達(dá)植株；也可用兩個基因的載體共轉(zhuǎn)化同一植物，篩選 獲得共表達(dá)植株；還可把兩個基因構(gòu)建到同一個T-DNA上，使轉(zhuǎn)基因工作更容易。本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以根據(jù)實際情況選擇合適的策略，進(jìn)而選擇使用哪個或者哪些重組載體組合。
[0023] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組載體中，包括所述表達(dá)貝伐單抗重鏈的基因和所述表 達(dá)貝伐單抗輕鏈的基因，即植物雙元表達(dá)載體，在本發(fā)明中，稱為貝伐單抗植物雙元表達(dá)載 體。
[0024] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組載體中，所用的載體為雙元表達(dá)載體。
[0025] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的重組載體中，所用的雙元表達(dá)載體為pBI 系列載體、pCAMBIA植物表達(dá)系列載體、pRTL系列載體或以它們?yōu)榛A(chǔ)的改造產(chǎn)物。在本發(fā) 明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的重組載體中所用的載體具體為質(zhì)粒PUN1301。
[0026] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組載體中的整合為整合到所用載體的T-DNA區(qū)域。
[0027] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組載體中，表達(dá)貝伐單抗重鏈的基因、表達(dá)貝伐單抗輕鏈 的基因中至少一個以表達(dá)盒的形式整合到所述載體中。
[0028] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的重組載體