一種裝甲ctla-4基因的rna標準物質及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質及其應用。
【背景技術】
[0002]細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4 (CTLA-4)是表達于激活T細胞表面，作為淋巴細胞激活的共刺激信號。在T細胞活化中起到負調節(jié)作用。它與淋巴細胞激活因子CD28起相反作用。但CTLA-4與CDA28分子在基因結構、染色體定位、序列的同源性及基因表達等方面都十分相近。氨基酸上兩者有31%同源性。具有同樣的相同的受體B7分子。但CTLA4與B7結合親和力比CD28與B7親和力高10~20倍，這就說明只要在少量CTLA-4情況下，即可阻斷CD28與B7的結合，從而抑制T細胞活化。當阻斷CTLA-4時，可以增加T細胞的激活或增殖。2010年抗CTLA-4單克隆抗體被FDA批準應用于不可切除或轉移性黑色素瘤?？笴TLA-4抗體針對免疫抑制檢驗點制備出針對腫瘤免疫只治療比較有效的抗腫瘤藥物。因此，對于CTLA-4的研宄是抗腫瘤有效方法。那么首先就是對CTLA-4因子核酸水平檢測?？梢岳煤怂釞z測方法可以準確、快速、靈敏的判定CTLA-4核酸水平。從而對抗CTLA-4單克隆抗體藥物的應用提供核酸水平的參考依據(jù)，最終提高藥物療效，使之高效的治愈腫瘤。
CTLA-4又稱⑶152，位于染色體2號長臂33，CTLA-4基因編碼的蛋白質有223個氨基酸，672個開放性閱讀框和4個外顯子。4個外顯子分別編碼一個引導序列、一個V區(qū)域、一個跨膜區(qū)域和一個胞質尾區(qū)。利用CTLA-4外顯子上特異性⑶S區(qū)可以檢測CTLA-4核酸的存在。作為核酸檢測CTLA-4的特異性靶點。目前國內還沒有診斷CTLA-4核酸檢測試劑及質控產品。因此，研制一種檢測CTLA-4核酸表達水平的質控樣品和標準物質，對于臨床檢測CTLA-4免疫因子表達情況具有重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術問題，在于提供一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物及其應用，該物質具有穩(wěn)定性，無生物傳染性，可真實模擬病毒粒子結構，耐核糖核酸酶等特性，可用于淋巴細胞CTLA-4基因mRNA水平檢測方法和試劑盒的陽性質控物質。
[0004]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:
一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質，所述裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質由如下步驟制得:
步驟10、獲得用于CTLA-4核酸檢測的C基因序列片段，如序列表中SEQ ID N0.1所示，所述C基因為CTLA-4基因中的一個片段；
步驟20、獲取包含MS2噬菌體成熟酶蛋白基因和衣殼蛋白基因的表達載體，具體過程如下:
根據(jù)MS2噬菌體基因序列，設計一對特異性引物，所述一對特異性引物如下:MCP1:5’_CGGGGTACCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGC-3’ ； MCP2: 5’-CGGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3’ ；預期擴增產物為MS2噬菌體的外殼蛋白和成熟酶蛋白基因，即CP基因，并引入雙酶切位點:Kpn I和BamH I ;分別雙酶切CP基因及PET32a載體，并將CP基因連接到PET32a載體上，最終得到PET32a-CP載體；所述CP基因序列如序列表中SEQ ID N0.4所示；
步驟30、CTLA-4 C基因和CP基因的表達載體的獲取，具體如下:
攜帶C基因的T載體，在Not I和BamH I雙酶切后，進行凝膠電泳后回收140bp小片段；同時進行PET32a-CP載體Not I和BamH I雙酶切，進行凝膠回收7115bp大片段，利用T4連接酶進行小片段和大片段連接，將C基因插入PET32a載體T7啟動子下游，獲得原核表達載體 PET32a-CP-CTLA-4 ；
步驟40、原核表達載體PET32a-CP-CTLA-4轉入原核表達菌株BL21 (DE3)PLySs中，誘導表達，采用冷凍低溫凍融，離心，純化后，獲得表達產物顆粒；
步驟50、將步驟40獲得的表達產物顆粒進行DNase I消化，然后離心棄沉淀，保留上清；加入終濃度4M硫酸銨，沉淀表達產物，離心棄上清，獲得沉淀即是含有CTLA-4基因的表達產物，最后用I XTE溶液重懸，獲得含有CTLA-4 C基因RNA假病毒顆粒產物；
步驟60、將含有CTLA-4 C基因RNA假病毒顆粒產物用TE緩沖液稀釋，進行VP病毒顆粒OD值測定，依據(jù)OD值換算稀釋產物，獲得內含CTLA-4基因RNA標準物質，即裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質。
[0005]進一步地，所述步驟10中，C基因可以通過體外化學合成或RT-PCR擴增獲得，并連接入T載體，其中T載體含有Not I和BamH I酶切位點；所述RT-PCR擴增引物如下:
Primer L:AGGGAAGTTTTGTGGAGGAGC ；
Primer R:GCACAATTCCACGCAATCA。
[0006]所述C基因片段處于CTLA-4的⑶S區(qū)域，該區(qū)域可用于體外克隆出人重組CTLA-4蛋白，因此對于CTLA-4具有特異性，可用于核酸檢測靶點的應用。
[0007]進一步地，所述步驟40具體如下:將原核表達載體PET32a-CP-CTLA_4載體轉入原核表達菌BL21 (DE3)PLySs，從中挑選出陽性克隆菌BL21 (DE3) PLySs接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，進行誘導表達；最后離心，收集菌體沉淀，用TE緩沖液或PBS洗滌；再次收集沉淀完成后放入-20°C至_80°C度冰箱中隔4-6小時取出至溫室，反復3-4次，離心，向沉淀中加入l~20mg/ml溶菌酶緩沖液，25~37°C孵育20_60min，離心棄去沉淀，獲得表達產物顆粒。
[0008]進一步地，所述緩沖液為20mM Tris、0.2M NaCl、ρΗ8.0。
[0009]進一步地，所述的一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質在免疫抑制因子CTLA-4核酸檢測中作為標準物質的應用。
[0010]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
(I) CLTA-4在未激活淋巴細胞中表達較少，在激活的T淋巴細胞表面上調表達。因此對于CTLA-4 mRNA微量檢測越靈敏對檢測結果越準確。采用核酸定量PCR的方法正好解決這個難題。本發(fā)明采用CTLA-4重組蛋白⑶S區(qū)域作為靶點序列，CTLA-4重組蛋白國內北京義翹神州生物技術有限公司已經上市(產品貨號#: 11159-H03H)。因此該CTLA-4靶點可以作為CLTA-4核酸水平的檢測。
[0011 ] (2)采用Armored技術進行標準物質的構建，應用噬菌體MS2衣殼蛋白包裹靶點核酸，可以有效防止RNase酶對靶點RNA的降解，對于RNA物質具有很好的保護作用，穩(wěn)定性強。
[0012](3)利用低溫凍融和溶菌酶法結合破碎表達菌株細胞。在_20°C以下環(huán)境下細菌在有水分的情況下在細胞內會形成冰晶，恢復室溫的過程中冰晶會破壞細菌細胞壁，使細胞破裂。同時再利用溶菌酶水解細胞壁肽聚糖鏈，破壞細胞壁立體空間結構，使細胞破碎更完全。如果只采用一種破碎方法或采用超聲波破碎，要么破碎程度不夠，要么操作時間長及步驟繁瑣。而且超聲波破碎易使核酸斷裂。因此本發(fā)明采用低溫凍融結合溶菌酶破碎方法可以有效解決上述問題。
[0013](4)利用DNase I對RNA標準物質進行消化，消除菌體基因組DNA對標準物質的影響。如果未對標準物質進行DNase I消化，DNA夾雜在標準物質中，對后續(xù)的熒光PCR產生假陽性的影響。PCR過程是一個指數(shù)級擴增過程，只要幾個拷貝的DNA即可產生假陽性現(xiàn)象。
[0014](5)利用飽和硫酸銨對標準物質進行提純。硫酸銨溶解度大、溫度系數(shù)小且不易是蛋白質變性，用它對標準物質進行沉析。由于標準物質是由病毒衣殼蛋白包裹著，因此可以進一步去除DNA核酸的干擾。
[0015](6)本發(fā)明的標準物質可以和樣本進行同時核酸提取，采用TE緩沖液稀釋模擬血液樣本對核酸提取過程可以全程監(jiān)控，確保檢測結果的準確性。
[0016](7)本發(fā)明的標準物質只米用嗤囷體MS2衣殼蛋白包裹，不含有嗤囷體復制蛋白酶，因此該標準物質無傳染性，無病毒特性，易于存儲與運輸。
【附圖說明】
[0017]下面參照附圖結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
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