量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法所述的步驟（1M3)建 立的SW480細(xì)胞的細(xì)胞分裂次數(shù)S與平均熒光強(qiáng)度11#的對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式為：S=-2. 61561og2 M末+16. 37847 ;所述步驟（1)中細(xì)胞孵育時(shí)間為25min，孵育過(guò)程中每lOmin將染液與細(xì)胞 懸液混勻一次。
[0017] 以細(xì)胞膜熒光染料DiO在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法所述的步驟（1M3)建 立的CT26細(xì)胞的細(xì)胞分裂次數(shù)S與平均熒光強(qiáng)度11#的對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式為：S=-2. 774491〇g2 M# +29. 27126 ;所述步驟（1)中細(xì)胞孵育時(shí)間為30min，孵育過(guò)程中每lOmin將染液與細(xì)胞 懸液混勻一次。
[0018] 以細(xì)胞膜熒光染料DiO在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法所述的步驟（1)~ (3) 建立的H印G2細(xì)胞的細(xì)胞分裂次數(shù)S與平均熒光強(qiáng)度M#的對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式為：S=-1. 4299 log2M# +18. 82296 ;所述步驟（1)中細(xì)胞孵育時(shí)間為2min。
[0019] 以細(xì)胞膜熒光染料DiO在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法所述的步驟（1) ~ (3)建立的SW620細(xì)胞的細(xì)胞分裂次數(shù)S與平均熒光強(qiáng)度％的對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式為： s=-l. 715331og2 +13. 34059 ;所述步驟（1)中細(xì)胞孵育時(shí)間為20min。
[0020] 以細(xì)胞膜熒光染料DiO在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法所述細(xì)胞膜熒光染料 DiO的結(jié)構(gòu)式為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用細(xì)胞膜熒光染料在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖速度的方法，其特征在于：為 如下步驟： 以細(xì)胞膜熒光染料染細(xì)胞：取細(xì)胞膜熒光染料配制成儲(chǔ)存濃度為lmm〇l/L的染液，將 儲(chǔ)存濃度為lmmol/L的染液加入到無(wú)血清培養(yǎng)基中配制成工作濃度為5~10umol/L的染液， 再將工作濃度為5~10umol/L的染液與重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液按體積比1:1混合， 并輕輕吹打，使充分混勻，然后置于37°C孵箱孵育2~30min，完成細(xì)胞染色；所述孵育時(shí)間 大于lOmin時(shí)，每lOmin將染液與細(xì)胞懸液輕輕吹打，混勻一次； 染色后細(xì)胞的培養(yǎng)：配制含不同血清濃度的培養(yǎng)基，將各培養(yǎng)基分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板 中，每孔2ml，每種血清濃度設(shè)立兩個(gè)復(fù)孔，將染色后的細(xì)胞以5X 104個(gè)/孔的密度平均鋪 于上述事先加入了含不同血清濃度培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37° C、5% C02、飽和濕度條 件下進(jìn)行染色后細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)； 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：培養(yǎng)一周后，收取細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞數(shù)目，以流式細(xì)胞 儀檢測(cè)每孔細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度；以M#為平均熒光強(qiáng)度，S表示細(xì)胞分裂次數(shù)，利用R軟 件經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，建立細(xì)胞分裂次數(shù)S與細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度M #的對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式：S=Alog2 M#+B，并利用excel繪制出對(duì)數(shù)擬合曲線；所述對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式中的系數(shù)A和B為常數(shù)， 由統(tǒng)計(jì)分析獲得；所述收取細(xì)胞的方法是：以濃度〇. 05%的胰酶細(xì)胞消化液Trypsin-EDTA 消化細(xì)胞l~3min，然后置于流式管中，以1000~1200rpm轉(zhuǎn)速離心3~8min，小心去上清后重 懸于200~500ulPBS磷酸鹽緩沖液中，重懸的緩沖液體積取決于細(xì)胞數(shù)量，調(diào)整細(xì)胞密度至 1 X 106/ml ； 體內(nèi)外細(xì)胞增殖速度的定量測(cè)定：測(cè)定待測(cè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度1#，然后根據(jù)步驟 (3)中建立的細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線或?qū)?shù)擬合關(guān)系式，計(jì)算得到細(xì)胞分裂次數(shù)S。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用細(xì)胞膜熒光染料在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法，其 特征在于：所述細(xì)胞膜熒光染料為細(xì)胞膜綠色熒光染料DiO或熒光染料PKH。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用細(xì)胞膜熒光染料在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法，其 特征在于：為如下步驟： (1) 以細(xì)胞膜熒光染料DiO染細(xì)胞：取細(xì)胞膜綠色熒光染料DiO配制成儲(chǔ)存濃度為 lmmol/L的DiO染液，將儲(chǔ)存濃度為lmmol/L的DiO染液加入到事先預(yù)熱至37°C的無(wú)血清 培養(yǎng)基中，配制成工作濃度為5umol/L的DiO染液，然后將工作濃度為5umol/L的DiO染液 與重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液按體積比1:1混合，輕輕吹打，充分混勻，然后將細(xì)胞置 于37°C孵箱孵育2~30min，每lOmin混勻一次； (2) 染色后細(xì)胞的培養(yǎng)： A.分別配制含血清濃度10%、5%、2. 5%、1. 25%、0. 625%的培養(yǎng)基，將各培養(yǎng)基分別加入 細(xì)胞培養(yǎng)板中，每種血清濃度設(shè)立兩個(gè)復(fù)孔； b.將步驟（1)獲得的染色后的細(xì)胞平均鋪于上述事先加入含不同血清濃度培養(yǎng)基的 細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37° C、5% C02、飽和濕度條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)； (3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制： a.培養(yǎng)一周后，以濃度0. 05%的胰酶細(xì)胞消化液Trypsin-EDTA消化細(xì)胞lmin，然后置 于流式管中，以llOOrpm轉(zhuǎn)速離心5min，小心去上清后重懸于200ul的PBS磷酸鹽緩沖液 中，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1 X 106/ml，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)每孔細(xì) 胞平均熒光強(qiáng)度； b.根據(jù)檢測(cè)得到的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度和細(xì)胞分裂次數(shù)，利用R軟件經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析獲得細(xì) 胞分裂次數(shù)S與平均熒光強(qiáng)度M#的對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式：S=Alog2 M# +B，并且利用excel繪制 出對(duì)數(shù)擬合曲線；所述對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式中的系數(shù)A和B為常數(shù)，由統(tǒng)計(jì)分析獲得。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用細(xì)胞膜熒光染料在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方 法，其特征在于：所述細(xì)胞孵育時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型確定，SW480細(xì)胞、Lovo細(xì)胞、CT26細(xì)胞孵 育時(shí)間為20~30min，IfepG 2細(xì)胞孵育時(shí)間2~3min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用細(xì)胞膜熒光染料在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法，其 特征在于：所述步驟（1)中，無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞密度小于0. 1 X 106/mL或大于10 X 106/mL 時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度為1 X 106/mL或調(diào)整DiO染液的體積，以滿足細(xì)胞膜染料DiO染細(xì)胞時(shí)的 濃度為5umol/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用細(xì)胞膜熒光染料在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法，其 特征在于：以所述的步驟（1) ~ (3)建立的Lovo細(xì)胞的細(xì)胞分裂次數(shù)S與平均熒光強(qiáng)度M 末的對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式為：S=_l. 793081og2 +16. 41884 ;所述步驟（1)中細(xì)胞孵育時(shí)間為 20min，孵育過(guò)程中每lOmin將染液與細(xì)胞懸液混勻一次。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用細(xì)胞膜熒光染料在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法，其 特征在于：以所述的步驟（1)~ (3)建立的SW480細(xì)胞的細(xì)胞分裂次數(shù)S與平均熒光強(qiáng)度 M末的對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式為：S=-2.61561og2 M#+16. 37847 ;所述步驟（1)中細(xì)胞孵育時(shí)間為 25min，孵育過(guò)程中每lOmin將染液與細(xì)胞懸液混勻一次。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用細(xì)胞膜熒光染料在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法，其 特征在于：以所述的步驟（1) ~ (3)建立的CT26細(xì)胞的細(xì)胞分裂次數(shù)S與平均熒光強(qiáng)度M 末的對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式為：S=_2. 774491〇g2 +29. 27126 ;所述步驟（1)中細(xì)胞孵育時(shí)間為 30min，孵育過(guò)程中每lOmin將染液與細(xì)胞懸液混勻一次。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用細(xì)胞膜熒光染料在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法，其 特征在于：以所述的步驟（1)~ (3)建立的H印G2細(xì)胞的細(xì)胞分裂次數(shù)S與平均熒光強(qiáng)度 M末的對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式為：S=-l. 4299 log2 M# +18. 82296 ;所述步驟（1)中細(xì)胞孵育時(shí)間為 2min〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述利用細(xì)胞膜熒光染料在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法，其 特征在于：以所述的步驟（1)~ (3)建立的SW620細(xì)胞的細(xì)胞分裂次數(shù)S與平均熒光強(qiáng)度 M末的對(duì)數(shù)擬合關(guān)系式為：S=-l. 715331og2 M# +13. 34059 ;所述步驟（1)中細(xì)胞孵育時(shí)間為 20min〇
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用細(xì)胞膜熒光染料在體內(nèi)外定量測(cè)定細(xì)胞增殖速度的方法，包括如下步驟：a）細(xì)胞膜熒光染料染細(xì)胞；b）不同濃度血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)染色后細(xì)胞；c）收取細(xì)胞，計(jì)數(shù)并檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度和細(xì)胞分裂次數(shù)利用統(tǒng)計(jì)軟件獲得對(duì)數(shù)擬合公式，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；通過(guò)每個(gè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度和細(xì)胞分裂次數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可測(cè)定體內(nèi)外一群細(xì)胞或細(xì)胞亞群的增殖速度。本方法可應(yīng)用于體外細(xì)胞分裂次數(shù)的定量檢測(cè)、體外腫瘤細(xì)胞亞群耐化療藥物的定量測(cè)定、體內(nèi)移植細(xì)胞的分裂速度，并能分選各個(gè)分裂速度不同的細(xì)胞亞群，測(cè)定分選后細(xì)胞的RNA、蛋白和生物功能。
【IPC分類】C12Q1-02
【公開(kāi)號(hào)】CN104531828
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410813341
【發(fā)明人】聶飚, 柳雪花, 鄧飛鴻, 陳金敏, 左俊華
【申請(qǐng)人】聶飚
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月24日